ICS 65.020.01 B 16 GD 中华人民共和国国家标准 GB/T 28973—2012 番茄环斑病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 Detection and identification of tomato ring spot virusNanoparticles-enlarged in colloidal gold immunochromatographic assay 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28973—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：邹明强、李锦丰、张永江、陈艳、戴华、马吉湘、田世民 I GB/T 28973—2012 引言 本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 该专利持有人：中国检验检疫科学研究院 联系人：邹明强 地址：北京市朝阳区高碑店北路甲3号中国检验检疫科学研究院邮编：100123 请注意除上述专利外，本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这 些专利的责任。 GB/T28973—2012 番茄环斑病毒检疫鉴定方法 纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 1范围 本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测番茄环斑病毒的原理、实验步骤及结果判 定等。 本标准适用于植物及其产品组织中番茄环斑病毒的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T23629—2009引进植物病原生物安全控制技术要求 GB/T23632—2009进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程 3. 番茄环斑病毒基本信息 中文名：番茄环斑病毒 学名：tomato ringspot virus 缩写：ToRSV 分类地位：豇豆花叶病毒科（Comoviridae)线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。 番茄环斑病毒的其他信息参见附录A。 方法原理 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规 番茄环斑病毒 5 仪器设备、用具及试剂材料 5.1仪器设备 天平（感量，1/10000g）、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。 5.2用具 微量移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、研钵、离心管等。 1 GB/T28973—2012 5.3试剂材料 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定番茄环斑病毒试剂材料（见附录B）。 6实验步骤 6.1生物安全与废弃物处理 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照 GB/T23629—2009中5.7进行处理。 6.2样品制备 称取1g植物或其产品组织，加人2mL样品提取缓冲液用研钵研磨，然后4℃下3000g～5000g 离心10min，取上清液制备成一个样品。 6.3样本存放 制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，应置一70℃以下，避免反复 冻融。 6.4病毒检测 6.4.1检测步骤 取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条（即开即用），置于平整的台面上，向样品垫中分别 加入被检样品、阳性对照和阴性对照各100μL，每个试验同时做平行。室温放置15min，观察检测线和 质控线条带。 6.4.2质量控制 质控线条带出现颜色，阳性对照检测线条带出现颜色，阴性对照检测线条带不出现颜色，检测结果 有效。如果质控线条带不出现颜色，或阳性对照检测线条带不出现颜色，或阴性对照检测线条带出现颜 色，出现任何一种现象以上者，说明检测结果无效，另选一批次试纸条重新按6.4.1操作。 6.4.3增敏实验 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加人100μL的PBST缓冲溶液进行清洗，反复清洗 3次，每次1min，然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加人30μL增敏试剂，室温反应5min～8min后， 观察检测线条带颜色， 6.4.4结果判定 检测线条带出现颜色，判定为阳性；检测线条带不出现颜色，判定为阴性。 注：增敏前条带颜色为红色，增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。 7结果的确认 可疑阳性样品应采用番茄环斑病毒RT-PCR检测方法进行确认。