ICS 65.020 B 16 备案号：33827-2012 海 南 DB46 省 地 方 标 准 DB 46/ T 220—2012 槟榔苗黄化病植原体 PCR 检测技术规范 Technical specification for PCR detection of arecanut yellow leaf phytoplasma of seedling 2012 - 04 - 18 发布 海南省质量技术监督局 2012 - 05 - 18 实施 发 布 DB46/ T 220—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由海南省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。 本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。 本标准首次发布于2012年4月。 I DB46/ T 220—2012 槟榔苗黄化病植原体 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了槟榔苗黄化病植原体的检测技术规范。 本标准适用于槟榔苗中槟榔黄化病植原体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 Ct 值 指荧光信号有统计意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数。 3.2 槟榔苗 用成熟种果育成的实生苗，育苗时间在两年以内的苗。 4 原理 以染色体DNA为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16S rRNA基因保守序列设 计通用引物，应用巢式PCR（nested – PCR）技术检测。根据16S rRNA基因序列设计翠菊黄化组（16SrⅠ 组）植原体特异性引物/探针组合，进行实时荧光PCR的检测。 5 仪器设备 台式高速冷冻离心机（最高转速在12000 rpm以上）、全自动数码凝胶图像分析系统、PCR仪、 全自动荧光定量PCR系统、全自动灭菌器、电子分析天平（万分之一）、旋涡混合器、水平电泳装置， 微量可调移液器（0.1-1000 μL)。 6 试剂和缓冲液配制 1 DB46/ T 220—2012 用于巢式PCR和实时荧光PCR检测的试剂和缓冲液配制，参见附录A。 7 检测方法 7.1 槟榔心叶总 DNA 提取 称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5 g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1 mL DNA提取缓冲液 充分研磨，然后加入80 µL 10%十二烷基肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1~2 h，4℃ 6000 rpm 离心10 min， 取上清液；加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻轻混匀，-20℃保持至少30 min，4℃ 8000 rpm离心15 min， 弃上清；加入600 µL TE缓冲液、30 µL 10%十二烷基硫酸钠和12 µL蛋白酶K（5mg/ml），轻轻彻底悬 浮沉淀，37℃温育30-60 min；加100 µL 5M NaCl混匀，再加入84 µL CTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10 min；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃ 6000 rpm 离心5 min，重复直至无中间白色层；取 上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，4℃ 6000 rpm离心5 min；取上清液， 加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃保持至少30 min，4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清液；加入500 µL 70% 乙醇洗涤，4℃ 12000 rpm离心10 min，洗涤两次；取沉淀，加入50 µL TE混匀溶解。加入5 μL RNaseA(10 μg/μl)，37℃ 30 min, 除去RNA。 7.2 巢式 PCR 检测 下述反应均需同时设植原体16S rDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对 照，设灭菌双蒸水作为空白对照。 7.2.1 引物序列 引物采用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1。 表1 巢式 PCR 检测的引物序列 7.2.2 引物名称 引物序列 5’-3’ R16mF2 CATGCAAGTCGAACGGA R16mR1 CTTAACCCCAATCATCGAC R16F2n ACGACTGCTAAGACTGG R16R2 GCGGTGTGTACAAACCCCG PCR 反应 PCR反应体系见表2。 PCR反应条件为：94℃，预变性2 min；94℃变性1 min；45℃退火45s，72℃延伸1 min；共进行30 个循环，最后72℃延伸10 min。 以R16mF2/R16mR1作为第一引物对，R16F2n/ R16R2 作为第二引物对，进行巢式PCR ( nested - PCR) 扩增，直接PCR以7.1中提取的总DNA为模板，巢式PCR以直接PCR产物稀释50倍后的样品为模板。PCR反应 体系和反应条件与直接PCR扩增相同。 表2 巢式 PCR 反应体系 组分 加样量（μL） 10×PCR buffer 2.0 25 mmol/L MgCl2 2.5 2 DB46/ T 220—2012 表2（续） 组分 加样量（μL） 10 mmol/L dNTPs 2.5 10 μmol/L 上游引物 1.0 10 μmol/L 下游引物 1.0 Taq DNA 聚合酶（5U/μL） 0.2 模板 DNA 1.0 补灭菌双蒸水至最终反应体系 25 μL 取5 µL PCR产物在1％琼脂糖凝胶（含0.5μg/ mL溴化乙锭）中电泳。利用Marker DL2000作为分子 量标准，在120V电场强度下电泳约20 min，最后用全自动数码凝胶图像分析系统照相。 7.2.3 PCR 产物序列 RFLP 图谱分析 将第二轮PCR产物进行序列测定，序列结果利用植原体分类鉴定的在线专用数据库-iPhyClassifier （http://plantpathology.ba.ars. usda. gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）进行RFLP图谱分析。 7.2.4 结果判定 巢式PCR检测结果判定见表3。 表3 巢式 PCR 检测结果判定简表 判定条件 第二轮 PCR 产物在 1.2 kb 处是否有条带出现（见图 B.1） 检测样品序列的 RFLP 图 谱分析结果与槟榔黄化病 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 结果判定 植原体标准图谱（见图 B.2）是否一致 否 否 是 是 是 检测样品含黄化病植原体 否 否 是 是 否 检测样品不含黄化病植原 否 否 是 否 - 体 否 否 否 - - 否 是 - - - 是 - - - - 7.3 检测结果无效，重新进行 巢式 PCR 检测。 实时荧光 PCR 检测 下述反应均需同时设植原体16S rDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对 照，设灭菌双蒸水作为为空白对照。 7.3.1 槟榔黄化病植原体引物/探针 引物和探针序列见表4。 3 DB46/ T 220—2012 表4 实时荧光 PCR 检测用引物/探针序列 引物/探针名称 引物/探针序列 5’-3’ PbLF GCGAAGGCGGCTTGCT PbLR TTTGCTCCCCACGCTTTC bFprobe FAM-CTTTACTGACGCTGAGGCA-MGBNFQ（FAM 指荧光报告基团， MGB 指小沟结合物，NFQ 指非荧光淬灭基团） 7.3.2 实时荧光 PCR 反应体系、反应条件 实时荧光 PCR 反应体系见表 5。 表5 组 实时荧光 PCR 的反应体系 分 终浓度或体积 R Universal RCR Master Mix TaqMan○ 12.5 μL 上游引物 PbLF 650 nM 下游引物 PbLR 650 nM 荧光探针 bFprobe 230 nM 模板 DNA 1 μL 补灭菌双蒸水至最终反应体系 25 μL 实时荧光 PCR 反应条件： 50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。 7.3.3 实时荧光 PCR 检测结果的判定 实时荧光 PCR 检测结果的判定见表 6。 表6 实时荧光 PCR 检测结果的判定简表 判定条件 荧光信号是否有增加（见图 B.3） 检测样品的 Ct 值 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 否 否 是 是 结果判定 是否小于等于 35 是 检测样品含黄化病植原体。 重新进行检测，若 Ct 值仍介于 35 否 否 是 是 否 和 40 之间，检测样品含黄化病植 原体。 否 否 是 否 - 否 否 否 - - 否 是 - - - 是 - - - - 检测样品不含黄化病植原体。 检测结果无效，重新进行实时荧 光 PCR 检测。 4 DB46/ T 220—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 巢式 PCR 和实时荧光 PCR 检测试剂和缓冲液配制 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。实验室用水均为去离子水，按GB/T 6682-2008的有关 规定。 A.1 化学试剂 十六烷基三甲基溴化铵、三羟基氨基甲烷、十二烷基肌氨酸钠、二水乙二胺四乙酸二钠、苯酚、氯 仿、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。 A.2 分子生物学试剂 Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP液（2.5 mmol/L dATP,dTTP, dCTP, dGTP)、TaqMan○R Universal RCR Master Mix、DNA分子量标记。 A.3 缓冲液 A.3.1 1M Tris-HCl（Ph8.0） 称量121.1 gTris置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，用盐酸调节PH值至8.0， 将溶液定容至1 L,高温高压灭菌后，室温保存。 A.3.2 0.5 M EDTA 称取186.1 g Na2•EDTA•2H2O，置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节 PH值至