ICS 65.020.01 B.16 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB 63/ T1002—2011 马铃薯抗晚疫病性室内评价技术规范 2011 - 06 - 14 发布 青海省质量技术监督局 2011 - 07 - 01 实施 发 布 DB63/ T1002—2011 前 言 本规范的编写符合GB/T 1.1-2009的要求。 本规范由青海省农林科学院提出并归口。 本规范起草单位：青海省农林科学院植物保护研究所。 本规范主要起草人：郭青云、王信、叶广继、朱海霞、程亮、姚强。 I DB63/ T1002—2011 马铃薯抗晚疫病性室内评价技术规范 1 范围 本规范规定了马铃薯品种（系）的试验地环境、参试质量和菌株选择、栽培技术、室内抗性鉴定方 法和抗病性评价。 本规范适用于马铃薯品种（系）晚疫病的室内抗性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 DB63/T 514 青海省旱地马铃薯栽培技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本规范。 3.1 抗病性鉴定 Evaluation of Disease Resistance 是评价寄主品种、品系对特定病害抵抗或感染程度。 3.2 离体叶片鉴定 Evaluation of Leaf in Vitro 将马铃薯品种（系）的叶片从植株上取下，经室内培养、人工接种而进行的抗性水平鉴定。 3.3 对照感病品种 Control Affected Variety 用于鉴定试验中的本地易感马铃薯品种。目前常用的感病品种有：大西洋、夏波蒂、Favorita。 3.4 脱毒马铃薯种薯 Virus-Free Seed Potato 去除马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）和马铃薯卷叶病毒（PLRV）马铃薯等主要病毒的马 铃薯种薯。 3.5 抗性评价 Evaluation of resistance 根据采用的技术标准判别寄主植物对特定病害反应程度和抵抗水平的定性描述。 1 DB63/ T1002—2011 4 仪器、试剂及材料 4.1 仪器 生物显微镜、光照培养箱、超净工作台、生化培养箱、冰箱、消毒锅、移液器、烧杯、培养皿（90mm）、 不锈钢打孔器（5 mm）、接种针、血球计数板和直尺。 4.2 试剂 琼脂、75 %酒精、蔗糖。 4.3 材料 黑麦。 5 试验地环境、参试马铃薯质量和菌株选择 5.1 试验地环境 试验地选择在远离50 m马铃薯种植区的区域。 5.2 参试马铃薯品种（系）选择 选择薯形整齐、纯度高、健康的脱毒马铃薯。 5.3 品种（系）田间种植数量 每品种（系）种植10株以上。 5.4 菌株的选择 选择青海省优势马铃薯生理小种2个—3个进行接种。青海省马铃薯晚疫病菌优势生理小种有：3， 4,10号、3,10号和3号。 6 栽培技术 按DB63/T 514执行。 7 室内抗性鉴定方法 7.1 培养基制备 7.1.1 滤纸培养基 直径 90 mm 的滤纸 2 张放入直径为 90 mm 的培养皿中，加蒸馏水润湿，但无积水，备用。 7.1.2 黑麦培养基 用蒸馏水浸泡 60 g 黑麦 24 h，高压滤灭菌 20 min，4 层纱布过滤，加入 18 g/L 琼脂，20 g/L 蔗 糖，蒸馏水定容至 1000 ml，湿热灭菌，在 121 ℃高压灭菌锅湿热灭菌 20 min 后备用。 2 DB63/ T1002—2011 7.2 取样 7.2.1 取样时间 待植株生长至8片-10片复叶后进行取样。 7.2.2 取样方法和数量 在每个品种（系）的各个植株中随机采集小叶叶片30片。 7.3 菌种繁殖和菌液制备 7.3.1 繁殖 将采回的病叶流水冲洗10 h-12 h，晾干后在超净工作台紫外杀菌30 min。选择易感晚疫病马铃薯 品种夏波蒂的块茎，75 %酒精消毒后在超净工作台上将块茎中间切一深槽，将病叶夹入槽内，用灭菌报 纸包好，室温黑暗处6 d-10 d，待薯块表面出现典型晚疫病症状，无菌条件下取3小块-4小块发病薯块 放入无菌培养皿中保湿培养4 d-7 d，待菌丝长出，挑取少量菌丝于黑麦培养基上18 ℃黑暗培养，待菌 丝呈放射状生长，在菌落边缘切取有单菌丝的培养基放在黑麦培养基上18 ℃黑暗培养。 7.3.2 菌液制备 用接种针挑取黑麦培养基上的菌丝体和孢子囊装有无菌水的烧杯中，生物显微镜镜检，用血球计数 板记录无菌水中的孢子囊的数量，调整孢子囊的数量为2000个/ml-3000个/ml，放入4 ℃的冰箱内0.5 h-1 h，取出后3 h内完成接种。 7.4 接种 将鉴定品种（系）的叶片叶背面朝上放在培养基上，用移液器取30 µL孢子囊悬浮液滴于叶片背面， 静置12 h左右，将叶片翻转成正面朝上，置光照培养箱中培养。 7.5 培养 在设定温度18 ℃，12 h黑暗,12 h光照的光照培养箱中培养。 7.6 调查时间 培养后的第4 d进行调查，连续调查3次，第7 d对抗病性进行综合评价。 7.7 调查方法 以叶片为单位，调查具有典型晚疫病症状（见附录A）的各个叶片，以病斑的长为准，用直尺按十 字交叉法测量病斑的长和宽。 7.8 计算方法 2 评价病斑面积（mm ）=1/4×长(mm)×宽(mm)×3.14 7.9 菌种保藏 根据待用时间的长短，菌种保藏可分短期保藏和长期保藏。 7.9.1 短期保藏 3 DB63/ T1002—2011 当菌种在5 d～6 d内使用时，将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分 用油纸包好，移至2 ℃～8 ℃的冰箱中备用。 7.9.2 长期保藏 当菌种利用灭菌的矿物油(液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，其油面高度应超过斜面顶部 l cm，以隔 绝斜面上菌种与空气接触，使之处于无氧条件下，以抑制菌种的生长与代谢活动，而培养基也不会干燥， 加入石蜡油的菌种管可以放在室温下，置于液氮或-80 ℃冰箱中。 8 抗病性评价 8.1 马铃薯品种（系）晚疫病病情分级见表 1 表1 8.2 马铃薯品种（系）晚疫病病情分级 病级 病情或症状 1 病斑面积为 0 2 病斑面积＜5% 3 5%≤病斑面积＜15% 4 15%≤病斑面积＜35% 5 35%≤病斑面积＜65% 6 65%≤病斑面积＜85% 7 85%≤病斑面积＜95% 8 95%≤病斑面积＜100% 9 病斑面积为 100% 鉴定有效性判别 室内鉴定中的高感对照品种发病病情指数达到66以上时，该批次抗晚疫病鉴定视为有效。 8.3 重复鉴定 初次鉴定中表现为高抗、中抗的材料，次年需用相同的病原菌进行重复鉴定。 8.4 抗性评价标准 依据鉴定品种（系）发病程度（病情指数和病斑面积）确定其对晚疫病的抗性水平，其评价标准见 表2。如果两年鉴定结果不一致，以抗性弱的发病程度为准。 表2 马铃薯品种（系）晚疫病抗性鉴定评价标准 抗病级别 病级 病情指数 高抗（HR） 1、2 0～15 抗病（R） 3、4 16～30 中抗（MR） 5 31～45 感病（S） 6 46～65 高感（HS） 7、8、9 66～100 4 DB63/ T1002—2011 8.5 鉴定记载表格 马铃薯抗晚疫病鉴定原始记录及结果记载表格见附录B。 5 DB63/ T1002—2011 AA 附 录 A （资料性附录） A.1 马铃薯晚疫病侵染植株症状 A.1.1 病原 Phytophthora infestans 称致病疫霉,属鞭毛菌亚门真菌。 A.1.2 症状 A.1.2.1 主要侵害叶、茎和薯块。 A.1.2.2 叶片染病，发病初期，先在叶尖或叶缘生水浸状绿褐色斑点，病斑周围具浅绿色晕圈，湿度 大时病斑迅速扩大，呈褐色，并产生一圈白霉，即孢子梗和孢子囊，尤以叶背最为明显，干燥时病斑变 褐干枯，质脆易裂，不见白霉，且扩展速度减慢。 A.1.2.3 茎部或叶柄染病，现褐色条斑。发病严重的叶片萎垂，卷缩，终致全株黑腐，全田一片枯焦， 散发出腐败气味。 A.1.2.4 块茎染病，初生褐色或紫褐色大块病斑，稍凹陷，病部皮下薯肉亦呈褐色，慢慢向四周扩大 或腐烂。 6 DB63/ T1002—2011 BB 附 录 B （资料性附录） B.1 马铃薯晚疫病室内病情调查记载见表B.1 表B.1 鉴定地点： 马铃薯晚疫病室内病情调查记载表 调查、记载人： 调查时间： 年 月 日 病情调查结果 品种（系） 叶片序号 长 宽 mm mm 叶片背面症状 1 2 3 …… 30 平均 1 2 3 …… 30 平均 7