ICS 11.220 B 41 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2012—2014 福氏阿米巴原虫检测方法 Detection of Naegleria fowleri 2014 - 02 - 28 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 04 - 30 实施 发 布 DB22/T 2012—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：曹利利、姚新华、苑淑贤、程荣华。 I DB22/T 2012—2014 福氏阿米巴原虫检测方法 警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了水环境中福氏阿米巴原虫的分离鉴定和聚合酶链式反应（PCR）检测方法的技术要求。 本标准适用于生活用水、畜舍蓄水池中福氏阿米巴原虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 耐格里属阿米巴原虫 Naegleria Spp. 耐格里属阿米巴属于双鞭毛阿米巴科原虫，多孳生于淡水中，有滋养体和包囊2个生活阶段，滋养 体呈长阿米巴型，大小为7×20 µm，在不良环境中可形成有2根鞭毛的滋养体；包囊圆形，直径9 µm， 单核。现知该属有5个种 N．gruberi, N．foweri，N．lovaniensis，N．jadini 和 N.austratiensis， 其中能致病的以福氏耐格里阿米巴原虫（N．fowleri）为主。人或动物接触污染水体或在游泳池游泳， 福氏耐格里阿米巴滋养体可侵入鼻腔增殖后穿过鼻粘膜和筛状板，经嗅神经上行入脑部寄生，引起急性 原发性阿米巴脑膜脑炎，因此又被称作“食脑虫”。 3.2 体外培养 in vitro culture 将寄生虫活体结构或活虫从寄生体内或外部环境中分离出来，放在类似的生存环境（模拟体内温度， 湿度，营养条件），让虫体生长发育的方法并维持其结构和功能。 3.3 聚合酶链反应 polymerase chain reaction [PCR] 1 DB22/T 2012—2014 聚合酶链反应（PCR）是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的 热变性，寡核苷酸引物复性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA 链延伸聚合反应的过程。 4 试剂与材料 4.1 引物 引物序列如下，引物浓度为15 pmol/μL。 上游引物：5’-GTG AAA ACC TTT TTT CCA TTT ACA-3’ 下游引物：5’-AAA TAA AAG ATT GAC CAT TTG AAA-3’ 4.2 试剂 除另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682中4.2二级水要求。 4.2.1 阿米巴生理盐水(Amebic Saline, 简称 AS)（见附录 A.1） 4.2.2 阿米巴无营养琼脂平板(Nonnutrient Agar, 简称 NNA)（见附录 A.2） 4.2.3 灭活大肠杆菌溶液（见附录 A.3） 4.2.4 阿米巴培养缓冲溶液（见附录 A.4） 4.2.5 真核细胞 DNA 提取试剂盒 4.2.6 标准分子量 DL2000 Marker 4.2.7 PCR 反应试剂盒 4.2.8 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液（见附录 A.5） 4.2.9 TAE 电泳缓冲液（见附录 A.6） 4.2.10 1.0%琼脂糖凝胶（见附录 A.7） 4.2.11 电泳上样缓冲液（见附录 A.8） 4.3 材料 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 5 滤器：滤孔 5 μm； 灭菌离心管：1.5 mL； PCR 反应管：0.2 mL； 量筒: 500 mL； 锥形瓶: 500 mL； 吸头: 10 μL、200 μL 、1000 μL； 琼脂平板。 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 2 PCR 扩增仪； Millipore 水过滤系统； 电泳槽； 核酸电泳仪； 紫外线透射仪或凝胶成像系统； 可调移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）； DB22/T 2012—2014 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 6 倒置显微镜； 恒温水浴锅：30-100℃； 恒温培养箱； 分析天平：感量 0.1 g； 接种环； 接种涂布器； 4℃冰箱。 样品 6.1 采集 6.1.1 采样地点 畜禽饮用水源、畜舍蓄水池等边缘。 6.1.2 采样位置 水面至水面下40 ㎝。 6.1.3 采样方法 用无菌试剂瓶直接取指定位置待检水样1000 mL。 6.1.4 运输保存 常温密封运输保存，20天内检测。 6.2 前处理 6.2.1 待检水样经单层纱布初步过滤，去除大的杂质物。 6.2.2 初过滤完的水样经 5 μm 滤膜孔的 Millipore 水过滤系统进行负压过滤，留滤膜待用。 7 检测 7.1 分离培养 7.1.1 接种观察 水样过滤完后，将滤膜翻转后盖于表面涂布灭活大肠杆菌的NNA培养基上， 接种后置于28℃培养24h， 倒置显微镜下观察滋养体生长情况以判断培养结果。 7.1.2 纯化培养 在20倍或40倍倒置显微镜下, 检查NNA 平板上的虫体集落并标记, 然后在涂有经灭活大肠杆菌的 NNA 平板反复转接培养直至无菌。 7.1.3 鞭毛体观察 刮取虫体, 放入盛有0.2 mL蒸馏水的1.5 mL的离心管中，室温放置1 h，混匀后取少量用100倍显微 镜观察鞭毛体。 3 DB22/T 2012—2014 7.2 PCR 鉴定 7.2.1 模版制备 刮取集落虫体，按DNA提取试剂盒说明书操作。 7.2.2 阳性及阴性对照 阳性对照：福氏耐格里阿米巴标准虫株（例如福氏耐格里阿米巴MW4U株），DNA提取按DNA提取试剂 盒说明书操作。 阴性对照：用灭菌蒸馏水做相同处理，作为标准阴性对照以及阴性模板。 7.2.3 PCR 反应体系 PCR为50 μL体系： a) 灭菌双馏水：26 μL； b) 10 倍 PCR 缓冲液：5 μL； c) dNTPs ：4 μL； d) 上游引物：2 μL； e) 下游引物：2 μL； f) 模板：10 μL ； g) Taq DNA 聚合酶：1 μL。 在0.5 mL反应管中按上述列表依次加入上述试剂，同时设立标准阴、阳性对照样品组和待检样品组， 做好标记。 7.2.4 扩增 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min； 4 ℃保存10 min。 7.2.5 扩增产物电泳 7.2.5.1 制胶 制备1.0%琼脂糖凝胶板（见附录A.7）。 7.2.5.2 上样 取8 μL PCR产物，与2 μL上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。同法加入阴、阳性对 照PCR产物及标准分子量DL2000 Marker。 7.2.5.3 电泳 5 V/cm电压，30 min。 7.2.5.4 观察 用紫外凝胶成像仪观察结果。 8 结果判定 4 DB22/T 2012—2014 8.1 耐格里阿米巴分离鉴定 8.1.1 生长轨迹特征 在NNA平板上呈放射性生长并在倒置显微镜下可见噬菌空斑的，可初步判定为样品中存在阿米巴原 虫（参考附录B.5）。 8.1.2 滋养体形态学特征 倒置显微镜下可见滋养体呈长圆形，外壁光滑，可初步判定为耐格里阿米巴原虫（参考附录B.4）。 8.1.3 鞭毛体特征 显微镜下可见一对或多根鞭毛的虫体，可初步判定为耐格里阿米巴属原虫（参考附录B.6）。 8.2 PCR 鉴定 PCR产物电泳后，可见311bp条带，且阴、阳性对照成立，可判定为福氏耐格里阿米巴原虫（参考附 录B.7）。 9 废弃物处理和防止污染的措施 9.1 检测过程中分区操作，防止交叉污染。 9.2 检测废弃物高压灭菌等无害化处理。 9.3 实验前后，实验室用紫外线消毒。 5 DB22/T 2012—2014 AA 附 录 A （规范性附录） 福氏阿米巴原虫检测试剂的配置 A.1 阿米巴生理盐水(AS) ——NaCl：120 mg； ——MgSO4.7H2O ：4 mg； ——CaCl.2H2O ：4 mg； ——Na2HPO4 ：142 mg； ——KH2PO4：136 mg； ——蒸馏水 ：1000 mL。 121℃ 15min灭菌，pH=6.8，4℃可保存6个月。 A.2 无营养琼脂平板（NNA） ——阿米巴生理盐水：100 mL； ——琼脂粉：1.5 g； 121℃ 15min灭菌，60℃浇琼脂平板。 A.3 灭活大肠杆菌溶液 制备大肠杆菌液体培养基（LB）1L： ——胰蛋白胨：10 g； ——酵母提取物：5 g； ——NaCl ：10 g； 调至PH=7.0，高压灭菌。 取5 mL LB培养基，接种单菌落大肠杆菌，37℃震荡过夜培养。大肠杆菌溶液121℃高压10min, 冷 却，4℃保存备用。 A.4 阿米巴培养缓冲溶液配制 ——KH2PO4：18.1 g； ——Na2HPO4：25 g ——蒸馏水：1000 mL； 调至PH=6.5。 A.5 溴化乙锭（EB）溶液 ——溴化乙锭：0.2 g； ——加灭菌蒸馏水至20 mL。 6 DB22/T 2012—2014 A.6 TAE电泳缓冲液制备 A.6.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH8.0） 。 ——二水乙二铵四乙酸二钠：18.6 g； ——灭菌蒸馏水：80 mL； ——氢氧化钠（1 mol/L NaOH）调pH值至8.0； ——灭菌蒸馏水加至100 mL。 A.6.2 50倍TAE电泳缓冲液配制 ——三羟甲基氨基甲烷（Tris）：242 g； ——冰乙酸：57.1 mL； ——0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH值8.0）：100 mL； ——灭菌蒸馏水加至 1000 mL。 作电泳液使用时，用双馏水50倍稀释。 A.7 1.0%琼脂糖凝胶板制备 ——琼脂糖：1 g； ——50倍TAE 电泳缓冲液：2 mL； ——灭