ICS 65.020 DB35 B16 福 建 省 地 方 标 准 DB 35/T 1219—2011 大豆疫霉菌土壤诱捕技术规程 Technical standard for baiting Phytophthora sojae from soil 2011 - 12 - 31 发布 福建省质量技术监督局 2012 - 03 - 15 实施 发 布 DB35/T 1219—2011 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 土壤诱捕方法 ...................................................................... 1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 4 诱捕方法 ...................................................................... 土样采集及处理 ................................................................ 大豆植株的种植 ................................................................ 药液的制备 .................................................................... 选择性培养基的配制 ............................................................ 土壤中大豆疫霉卵孢子的孵育 .................................................... 大豆叶碟制备 .................................................................. 大豆疫霉菌的诱钓 .............................................................. 大豆疫霉菌的分离 .............................................................. 鉴定及纯化 ................................................................... 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 土壤诱捕后相关材料的处理 .......................................................... 3 I DB35/T 1219—2011 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则进行编写。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：兰成忠、陈庆河、翁启勇、李本金、赵健、邱荣洲。 II DB35/T 1219—2011 大豆疫霉菌土壤诱捕技术规程 1 范围 本标准规定了大豆疫霉菌土壤诱捕技术的土壤诱捕方法、土壤诱捕后相关材料的灭活处理的方法。 本标准适用于大豆疫霉菌的土壤诱捕。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 叶碟诱钓法 Leaf disc baiting method 用感病大豆品种苗期真叶的叶片对土壤中大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）进行诱集，将诱集到 的大豆疫霉菌转接到感病大豆品种的叶片上孵育。 2.2 选择性培养基 Selective medium 用于土壤中大豆疫霉菌诱捕的含抗生素及抑制其它菌物生长的胡萝卜水琼脂培养基。 2.3 选择性诱集 Selective baiting 采用大豆疫霉菌感病品种叶片对土壤中大豆疫霉菌进行诱集，而排除了土壤中其它菌物，再将诱捕 后的叶片接种于大豆苗植株上，以提高大豆疫霉菌的分离率。 2.4 感病品种 Sensitive variety 在土壤诱捕过程中使用了不含有大豆疫霉菌抗性基因的感病品种Williams或感病品种毛豆75。 3 土壤诱捕方法 3.1 诱捕方法 采用叶碟诱钓法。 3.2 土样采集及处理 1 DB35/T 1219—2011 在大豆种植区选择代表性田块随机取不少于5个样点，每点取表层2 cm~15 cm以内的土壤500g，将 采集的土壤在室温下风干、混匀，碾碎后过孔径为2 mm的试验筛，装入塑料袋密封，4 ℃条件下保存备 用。 3.3 大豆植株的种植 感病大豆品种播种于以新蛭石为基质、直径为6 cm~10 cm营养杯中，每杯1株，育苗期温度控制在 20℃~30℃。 3.4 药液的制备 分别称取含有效成分 0.50 g（准确至 0.0002 g）的青霉素原粉、含有效成分 0.50 g（准确至 0.0002 g） 的利福平原粉、含有效成分 0.50 g（准确至 0.0002 g）的五氯硝基苯原粉、含有效成分 0.50 g（准确至 0.0002 g）的多菌灵原粉，分别置于带有标签的 1000 mL 容量瓶中；青霉素原粉用蒸馏水溶解并定容， 使得最终浓度为 1×104µg/mL；利福平原粉用无水乙醇溶解并定容，使得最终浓度为 1×104µg/mL；五 氯硝基苯用适量的甲苯溶解后，用 0.1 %吐温-80 水溶液稀释并定容，使得最终浓度为 5×104µg/mL；多 菌灵用适量的二甲基甲酰胺溶解后，用 0.1 %吐温-80 水溶液稀释并定容，使得最终浓度为 5×104µg/mL； 摇匀，使用前按 1:1:1:1 体积比混合。 上述药液配制时，可根据试验的需要相应增加或减少配制体积，但所配制成的各种药液最终有效成 分的质量体积比应保持不变。 3.5 选择性培养基的配制 称取200 g新鲜胡萝卜，切成小片后置于组织打碎机腔中，加入去离子水500 mL，启动组织打碎机 捣碎约40 s，倾出组织捣碎液，用4层纱布过滤，滤过液置于1000 mL量杯中，补足去离子水到1000 mL， 倾入可加热的容器中，加入琼脂16 g，加热至琼脂完全融化，立即分装于带棉花或硅胶塞的三角瓶中， 在121℃下蒸汽灭菌20min后，冷却至60 ℃~70 ℃（不烫手），加入3.4所配制的药液4mL，倒入已灭菌 的培养皿中制成平板，备用。 3.6 土壤中大豆疫霉卵孢子的孵育 称取自然风干且过孔径为2 mm的试验筛的土样30 g，平铺在直径为9 cm的培养皿中。将3.4所配制 的药液稀释100倍，每个皿缓缓加入已稀释好的药液12 mL，使土壤均匀湿润（土壤含水量大约为35 %）， 加盖后用密封膜封紧。倒置于25 ℃培养箱内，孵育7 d。 3.7 大豆叶碟制备 用直径为10 mm的打孔器打取感病品种的充分长大的大豆嫩叶，制成圆形叶碟。 3.8 大豆疫霉菌的诱钓 在盛有孵育后土样的培养皿中加入蒸馏水16 mL，用灭菌过的吸水纸将培养皿水面的漂浮物清洁干 净后立即加入3.7制备的大豆叶碟，每个皿放置20片，加盖后置于25 ℃黑暗条件下诱捕48 h。 3.9 大豆疫霉菌的分离 取出诱捕后的大豆叶碟，在无菌水中漂洗干净，转入装有15 mL蒸馏水的培养皿内，25 ℃光暗交替 条件（光：暗=3.5：3.5）下孵育7 h后，肉眼观察叶碟上是否出现小黑点。取出叶碟接种于生长10 d~15 d的感病大豆植株，在下胚轴近叶处用解剖刀轻轻向下划约0.5 cm长的伤口，将诱捕后出现小黑点的叶 碟贴在伤口处，接种部位用湿棉花包裹。接种后的大豆苗在25 ℃条件下保湿48 h，取下棉花，接种苗 2 DB35/T 1219—2011 放入18 ℃~25 ℃温室下正常管理培育，接种3 d后观察接种部位的发病情况。取病健交界处的组织用3.5 所配制的选择性培养基进行分离培养。 3.10 鉴定及纯化 将分离所得到疑似大豆疫霉菌的菌落进行形态学鉴定，具体的鉴定特征如下：菌落白色，气生菌 丝致密呈棉絮状；显微镜下观察，菌丝体无横隔、分枝处大多呈近直角、分枝基部稍缢缩，少量菌丝形 成结节状菌丝膨大体；孢囊梗单生，孢子囊均为顶生式，呈椭圆形，乳突不明显，孢子囊内层出现象明 显，成熟后不脱落，孢子囊成熟后很快释放游动孢子；可产生大量卵孢子，藏卵器具薄壁、球形或近球 形，雄器侧生，偶有围生，卵孢子圆形，内外两层壁，壁光滑。菌体形态符合上述特征的可认定为大豆 疫霉菌（Phytophthora sojae）的菌株。 挑取大豆疫霉菌菌落边缘的单菌丝段，置于3.5制备的培养基斜面上，25℃~28℃恒温下黑暗培养8 d～10 d，当培养基斜面上长满菌丝后，灌注灭菌过的液体石蜡密封，置于13℃黑暗中保存。 4 土壤诱捕后相关材料的处理 4.1 所有与本实验有关的土壤均采用干热 160 ℃灭菌 1 h。 4.2 将接大豆叶碟后的大豆病株经煮沸 15 min。 4.3 用于栽培大豆苗的盆钵带回实验室，80 ℃水浴处理 2 h 以上。 _________________________________ 3 DB35/T 1219－2011 福 建 省 地 方 标 准 大豆疫霉菌土壤诱捕技术规程 DB35/T 1219—2011 * 2012 年 2 月第一版 2012 年 2 月第一次印刷