ICS 65.020 B 61 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2083—2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP 法 Verification of genuineness for edible mushroom spawn — RAMP 2014 - 05 - 04 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 06 - 01 实施 发 布 DB22/T 2083—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001 给出的规则起草。 本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学。 本标准主要起草人：宋慧、刘晓龙、金周雨、汤海峰、宗立立、李雨婷、王健、谭旭华、李艳丽。 I DB22/T 2083—2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP 法 1 范围 本标准规定了利用RAMP技术鉴定食用菌菌种真实性的分析步骤、结果记录、分析鉴定的方法。 本标准适用于猴头菌（Hericium erinaceus）、小刺猴头菌（Hericium caput-medusae）、珊瑚状 猴头菌（Hericium coralloidesPers）、黑木耳（Auricularia auricular）和光帽鳞伞（Pholiota nameko） 食用菌菌种真实性的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 12728 食用菌术语 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 随机扩增微卫星 DNA 多态性标记 Random Amplified Microsatellite Polymorphism（RAMP） 是以 1 条与微卫星序列互补的 SSR 引物和 1 条 RAPD 随机引物相组合，对基因组中的微卫星序列与 随机引物互补序列之间的 DNA 片段进行随机扩增的技术。 3.2 菌种真实性 Verification of Spawn 供检菌种与对照菌种的符合性 4 RAMP 标记原理 采用RAMP标记扩增基因组中微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段，通过比较试样与对照 指纹图谱，从而对菌种进行鉴定。 5 仪器设备及试剂 见附录A。 6 溶液配制 1 DB22/T 2083—2014 见附录B。 7 分析步骤 7.1 菌丝培养 7.1.1 培养基的制备 3 称取去皮马铃薯200.0 g，制备成均匀碎块（约1cm ），加蒸馏水1000 mL，煮沸30 min，滤除固体 残渣，在马铃薯汁液中加入葡萄糖20.0 g，硫酸镁 0.5 g，磷酸二氢钾0.46 g，磷酸氢二钾1.0 g，琼 脂18.0 g，加热使其充分溶解，定容至1000 mL，pH自然，装入试管，塞好试管塞。121℃-126℃，高压 灭菌30 min，摆成斜面冷却后使用。 7.1.2 接种 将供检菌株与对照菌株在相同条件下培养，培养量可供做3个平行鉴定试验。将待供检菌株与对照 菌株在无菌条件下，切取（3～5）mm×（3～5） mm大小一块母种，迅速转移至试管斜面培养基中央位 置，每个菌株接种20支～30支试管。 7.1.3 恒温培养 将接种后的试管置恒温培养箱中，分别在25 ℃条件下避光培养黑木耳9 d～12 d，猴头菌、小刺猴 头菌、珊瑚状猴头菌培养12 d～15 d；在20 ℃条件下避光培养光帽鳞伞15 d～20 d。 7.2 DNA 提取 7.2.1 称取 0.1 g 的菌丝置于无菌研钵中，在液氮中充分研磨成粉末； 7.2.2 将菌丝粉末迅速转移至 1.5 mL 离心管中，加入 600 µL 的 65 ℃预热的 CTAB DNA 提取缓冲液， 置于 65 ℃水浴 45～60 min，每 5 min～15 min 颠倒混匀； 7.2.3 加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提 10 min，颠倒混匀，4 ℃，12000 rpm 离心 5 min； 7.2.4 取上清加等体积氯仿-异戊醇（24:1）抽提 10 min，颠倒混匀，4 ℃ ，12000 rpm 离心 5 min， 重复 7.2.4 抽提 1 次； 7.2.5 加等体积异丙醇-20 ℃充分沉淀； 7.2.6 4 ℃，5000 rpm 离心 10 min，弃上清； 7.2.7 加 500 µL 的 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次，室温干燥，加 40 µL 的 TE 缓冲液（pH 8.0）溶解； 7.2.8 加入 10 mg/mL 的 RNase 溶液至终浓度达 50 μg/mL，去除 RNA，37 ℃水浴 1 h； 7.2.9 重复操作 7.2.3～7.2.5，加入 100 μL TE 缓冲液（pH 8.0），使 DNA 充分溶解，并置于 4 ℃冰 箱中保存备用 注：长期保存应采用-20 ℃；多次测定需分装保存，每次使用后不再重新冻存。 7.3 DNA 纯度检测 7.3.1 电泳检测 取 1% 琼脂糖溶液 40 mL 加入 4 µL 的溴化乙锭，缓慢倒入凝胶托盘中冷却，避免出现气泡，插入 梳子，待胶体凝固后，缓慢拔出梳子，将凝胶托盘置于装有 1×TAE 缓冲液的水平电泳槽中；在凝胶点 样孔中加入 5 µL 菌株 DNA 提取液与 2 µL 的 6×Loading buffer 的混合液体，用 5 µL 的 λHindⅢ Marker 作为参照；采用 100 V 恒压电泳，待溴酚蓝前沿指示剂移动到距凝胶前沿 0.5 cm～1 cm 处，停止电泳 2 DB22/T 2083—2014 （约 1 h）；在凝胶成像系统中观察并照相；电泳条带应呈现单一清晰状态，否则重新提取 DNA。 7.3.2 紫外检测 取3 µL DNA提取液，用无菌水稀释至一定倍数，混匀后，加入石英比色皿中，加入量为比色皿体 积的3/4，并以无菌水或TE缓冲液为空白对照，用紫外-可见分光光度计分别在260 nm和280 nm下测量其 OD值，计算OD260/OD280比值，如果该比值在1.6~1.8之间，可以进行PCR反应，否则重新提取DNA。 待测样品含量（µg/mL）=OD260 值×稀释倍数×50 7.4 PCR 扩增 7.4.1 RAMP 引物及其使用 由4条SSR引物和10条RAPD引物组成40对核心引物。使用时首先选用5对参见附录C（按菌种分类引 物）。如果没有得到好的结果，则选用其他组合。 7.4.2 PCR 反应体系 25 µL的反应体积，含dd H2O为3.25µL，10×PCR 缓冲液为2.50µL，2.5 mmol/L dNTPs为 2.00µL， 10 µmol/L Primer1为1.00µL，10 µmol/L Primer2为1.00µL，5 U/µL Taq DNA聚合酶为0.25µL，5 ng/µL DNA模板为15.00µL。 7.4.3 PCR 反应程序 设置空白对照。 94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，共45个循环；72℃延 伸10 min，4℃保存。 7.5 PCR 产物电泳检测 参见7.3.1方法。配制2% 琼脂糖凝胶，在点样孔中加入5 µL的 菌株PCR产物与2 µL的6×Loading buffer的混合液体，取DL2000 Marker和150 bp Marker各3 µL混合后作为参照。 8 结果判定 电泳结束，将凝胶置于凝胶成像仪或紫外透射仪观察，照相保留实验结果。 如果三个平行结果一致，实验结果可以使用。 供检菌株与对照菌株差异明显，判定供检菌株与对照菌株不属于同一菌种或同一品种，如只出现一 对引物差异，则判定为近似菌种或近似品种。 供检菌株与对照菌株之间的谱带未检测出差异，再选定5个引物做进一步验证试验。必要时可增加 其他方法佐证。 3 DB22/T 2083—2014 AA 附 录 A （规范性附录） 主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 A.1.1 A.1.2 A.1.3 A.1.4 A.1.5 PCR扩增仪； 紫外-可见分光光度计； 凝胶成像系统或紫外透射仪； 4 冷冻离心机（能离心0.2～1.5 mL离心管，转速在1×10 rpm以上）； 高压灭菌装置（可以达到温度121.3 ℃，压力0.15 MPa）； A.1.6 A.1.7 A.1.8 A.1.9 A.1.10 A.1.11 A.1.12 A.1.13 A.1.14 A.1.15 超净工作台； 分析天平（感量0.0001 g）； 微量移液器：规格分别为10 mL、20 mL、100 mL、200 mL、1000 mL，连续可调； 酸度计； 恒温培养箱； 冰箱：最低温度-20℃； 水浴锅或金属浴：控温精度±1℃ 电泳仪（具有稳流4～400 mA连续可调和稳压5～500 V连续可调） ； 水平电泳槽及配套的制胶附件； 照相系统。 A.2 主要试剂 A.2.1 A.2.2 A.2.3 A.2.4 A.2.5 A.2.6 A.2.7 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB） ； 聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40) 溴酚蓝 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）； 三羟甲基氨基甲烷（Tris-base） ； β-巯基乙醇 苯酚 A.2.8 A.2.9 A.2.10 A.2.11 A.2.12 A.2.13 A.2.14 A.2.15 A.2.16 A.2.17 三氯甲烷； 异丙醇：（2-丙醇;二甲基甲醇; C3H8O；CAS RN:67-63-0） 异戊醇； 盐酸； 氢氧化钠（NaOH）； 氯化钠； 10×Buffer缓冲液：含Mg2+ 25 mmol/L； 四种脱氧核苷三磷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP（10 mmol/L each） ； Taq DNA聚合酶：2 U/mL； 琼脂糖； 4 DB22/T 2083—2014 A.2.18 DNA分子量标准：DL2000； A.2.19 核酸染色剂；按说明使用。 （警告——使用本试剂的人员应有正规实验室的工作经验。本标准 并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有 关法规规定的条件。） A.2.20 甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）； A.2.21 丙烯酰胺（acrylamide）； A.2.22 无水乙醇； A.2.23 四甲基乙二胺（TEMED）； A.2