ICS 11.220 B 41 备案号:38105-2013 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 894—2013 猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅣ-ELISA 抗体 检测方法 Enzyme-linked immunosorbent assay to detect the antibody against ApxⅣ of Actinobacillus pleuropneumoniae 2013 - 03 - 14 发布 湖北省质量技术监督局 2013 - 06 - 01 实施 发 布 DB42/T 894—2013 目  次 前言...................................................................................................................................................................... II 引言..................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件.............................................................................................................................................1 3 缩略语............................................................................................................................................................. 1 4 检测原理......................................................................................................................................................... 1 5 检测条件......................................................................................................................................................... 2 6 检测材料......................................................................................................................................................... 2 7 检测方法......................................................................................................................................................... 2 8 结果判定......................................................................................................................................................... 3 9 注意事项......................................................................................................................................................... 3 附录 A ................................................................................................................................................................. 4 附录 B ................................................................................................................................................................. 6 I DB42/T 894—2013 前  言 本文件按照 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫病预防控制 中心。 本标准主要起草人：周锐、金梅林、陈焕春、宋念华、董晓辉、金卉。 II DB42/T 894—2013 引  言 猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种猪的重要呼吸道传染病，以纤维性、出血性、坏死性胸膜炎和肺炎 为主要特征，多呈急性经过，导致感染猪急性死亡。急性感染耐过猪或隐性感染猪会影响日增重，延迟 出栏时间。本病呈世界性分布，是危害养猪业最严重的呼吸道细菌性传染病之一。 ApxIVA 是 APP 特异性的体内诱导抗原。本标准以 ApxIVA 重组蛋白为抗原建立的间接 ELISA 抗 体检测方法，不仅适用于 APP 感染的特异性诊断，而且可以用于区分 APP 灭活疫苗或 ApxIV 基因缺失 疫苗免疫猪与自然感染猪的鉴别诊断。 本标准参照国家二类新兽药“猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxIV-ELISA 抗体检测试剂盒”（2010 新兽药 证字 49 号）的质量标准及其使用说明书制定，为国内首次提出。 III DB42/T 894—2013 猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅣ-ELISA 抗体检测方法 1 范围 本标准规定了猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅣ抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法的缩略语、 检测原理、检测条件、检测材料、检测方法、结果判定和注意事项等。 本标准适用于猪血清中胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅣ的抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 兽用生物制品质量标准汇编（2010） 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测试剂盒质量 标准。 GB/T 6682-2008 中国实验室用水国家标准。 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 猪胸膜肺炎放线杆菌 Actinobacillus pleuropneumoniae APP 胸膜肺炎放线杆菌 ApxIV 毒素的 A 蛋白 ApxIVA 酶联免疫吸附试验 Enzyme-linked immunosorbent assay 630 纳米波长处的吸光值 OD630nm 值 阳性对照孔 OD630nm 值的平均值 样品孔 OD630nm 值 4 ELISA P S 检测原理 ApxIVA 毒素是 APP 种特异性的外毒素，但在体外培养 APP 时并不能够检测到 ApxIVA 毒素，只 有在感染猪体内才能够检测到 ApxIVA 毒素及其抗体，因此，通过检测猪血清中 ApxIVA 毒素的抗体， 可以诊断猪是否感染了 APP。 APP 的 ApxIVA 抗体 ELISA 检测技术是利用被检样品中的抗体与包被在酶标板上的 ApxIVA 抗原 发生反应，然后通过洗涤把未结合的抗体及其他物质去除。再加入羊抗猪 IgG 酶标抗体，酶标抗体与 抗原抗体复合物结合，加入底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的颜色深浅与样品中抗体的量呈正 相关，故可根据 OD630nm 值判定被检样品中 ApxIVA 的抗体水平。 5 检测条件 1 DB42/T 894—2013 5.1 环境温度 检测过程宜在室温（18 ℃～25 ℃）进行。 5.2 主要仪器 台式低温离心机、微量移液器、2 ℃～8 ℃冰箱、恒温箱、酶标检测仪。 6 检测材料 猪胸膜肺炎放线杆菌重组 ApxIVA 蛋白、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪 IgG 酶标抗体、96 孔酶标板、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、底物液 A、底物液 B、终止液。试剂的配制见附录 A。 7 检测方法 7.1 样品处理 取待检测猪的血液，待血液凝固后，以 4000 r/min 离心 10 min，收集血清。也可采集血液，待凝固 后自然析出血清。血清呈淡黄色，无严重溶血。具体血液采集与样品处理注意事项见附录 B。 7.2 包被 用包被液将抗原（猪胸膜肺炎放线杆菌重组 ApxIVA 蛋白）稀释到工作浓度（6.25 µg/mL）加入酶 标板孔内，每孔 100 µL，37 ℃孵育 1 h 后，再置 2 ℃～8 ℃，8 h～10 h。 7.3 封闭 取出抗原包被板，弃去孔中包被液，在干净的吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液 120 µL，静置 3 min， 弃去洗涤液后拍干，重复洗涤 3