ICS 67.120.30 B 50 备案号：35809-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1676—2012 冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定 多重 PCR 法 Determination of food-borne bacterial pathogens from frozen squid—— Multiple PCR 2012 - 12 - 17 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1676—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4给出的规则起草。 本标准由珲春出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珲春出入境检验检疫局综合实验室、吉林农业大学。 本标准主要起草人：聂丹丹、王宁宁、陶希三、杨文光、席家文、谭立新、李晶、张琦、宋立甫、 赵欣玥。 I DB22/T 1676—2012 冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定 多重 PCR 法 1 范围 本标准规定了冻鱿鱼中沙门氏菌Salmonella、单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes、 副溶血性弧菌Vibrio parahemolyticus及霍乱弧菌Vibrio cholerae的多重PCR方法。 本标准适用于冻鱿鱼中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.7 食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB/T 4789.20 食品卫生微生物学检验 水产食品检验 GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 1022 进出口食品中霍乱弧菌检验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) DNTP：脱氧核苷酸三磷酸（Deoxyribonucleoside Triphosphate） DATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate） DCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine Triphosphate） DGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate） DTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine Triphosphate） SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl) Aminomethane） CTAB：十六烷基三乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromide） TE：Tris-HCl与 EDTA（pH 8.0）混合缓冲液 Taq 酶: Taq DNA 聚合酶 4 防污染措施 按照WS/T 230-2002中6的规定执行。 1 DB22/T 1676—2012 5 试剂和材料 除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。 5.1 标准菌株 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、 副溶血性弧菌、霍乱弧菌及其他致病菌的所有培养物和小心处置废物，并按GB 19489中的有关规定执 行。 阳性菌株：沙门氏菌ATCC 12011；单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19111；副溶血弧菌ATCC 17802； 霍乱弧菌JL.08108。 阴性菌株：（对照采用任意一种非目标菌）李斯特菌ATCC 19119；普通变形杆菌ATCC 33420；金黄 色葡萄球菌ATCC 12600；小肠耶尔森菌ATCC 23715；大肠杆菌ATCC 11229；克雷伯氏菌ATCC 43086；粪 肠球菌ATCC 14500；蜡样芽胞杆菌ATCC 11176。 5.2 试剂 5.2.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2.2 DNA 提取液：主要成分是 CTAB，Tris，EDTA。 5.2.3 蛋白酶 K。 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.2.11 5.2.12 5.2.13 RNA 酶。 三氯甲烷（氯仿） CHCl3。 异戊醇 C5H12O。 无水乙醇 C2H5OH。 TE 缓冲液（见附录 A.1）。 10×PCR 缓冲液。 Taq DNA 聚合酶。 DNA 分子量标记物（100 bp～1 000 bp）。 PCR 反应管（1.5 mL、200 μL）。 常见致病菌普通 PCR 检测试剂盒。 5.2.14 琼脂糖。 5.2.15 10×上样缓冲液（见附录 A.2）。 5.2.16 50×TAE 缓冲液（见附录 A.3）。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 PCR 仪。 电泳装置。 凝胶分析成像系统。 生物安全柜。 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 低温冰箱（-80 ℃）、冷藏冷冻冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃）。 高压灭菌锅。 恒温水浴箱（室温～100 ℃）。 高速台式离心机(离心转速 12 000 r/min 以上)，台式离心机（离心转速 2 000 r/min）。 微量可调移液器（2 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL）。 2 DB22/T 1676—2012 7 检测程序 普通PCR方法检测程序参见附录B。 8 样品制备 样品应冷冻保存，解冻后应尽快依照GB/T 4789.20的相关规定，在无菌条件下对鱿鱼进行局部取样， 取样25 g（mL）加入到含有225 mL无菌培养液中，在拍击式均质器上连续均质1 min～2 min。 9 操作步骤 9.1 增菌培养和分离 9.1.1 9.1.2 9.1.3 9.1.4 沙门氏菌按照 GB 4789.4 方法进行。 单核细胞增生李斯特氏菌可按照 GB 4789.30 方法进行。 副溶血性弧菌按照 GB 4789.7 方法进行。 霍乱弧菌按照 SN/T 1022 方法进行。 9.2 细菌模板 DNA 的提取 对于上述方法培养的增菌液，各取增菌液1 mL均加到一个1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入500 μL CTAB、40 μL蛋白酶K，震荡均匀，65 ℃ 温浴30 min；加入500 μL三 氯甲烷：异戊醇（24：1），震荡，12 000 r/ min 离心15 min；吸取上层水相至1. 5 mL离心管中，加 入等体积的异丙醇，震荡均匀，12 000 r/ min离心10 min；弃上清液，用预热至65 ℃ TE缓冲液溶解 DNA（TE量视DNA沉淀的多少而定）；加入5 μL RNA 酶溶液，37 ℃ 温浴30 min；加入200 μL三氯甲烷： 异戊醇（24：1），震荡，12 000 r/ min 离心15 min；吸取上层水相至新的1. 5 mL 离心管中，加入 等体积的异丙醇，震荡均匀，12 000 r/ min 离心10 min；弃上清液，加入70 %乙醇洗涤沉淀DNA，12 000 r/ min离心1 min；弃上清液，干燥，加50 μL预热至65 ℃TE缓冲液溶解DNA。（如不能及时检验，可将 上清液于-20 ℃ 保存）。 也可使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。如不能及时检验，提取的DNA可 于-20 ℃ 保存。 9.3 多重 PCR 扩增 9.3.1 引物 沙门氏菌的主要毒力因子invA作为本研究选用的靶基因；绝大多数单核细胞增生李斯特氏菌毒力基 因的转录表达受到prfA蛋白的调控，因此作为单核细胞增生李斯特氏菌的靶基因；副溶血性弧菌的靶基 因选用的是具有种属特异性的不耐热tlh；OmpW是霍乱弧菌的主要外膜蛋白之一，本研究采用其作为靶 基因。引物的序列参见附录C中C.1。 9.3.2 空白对照、阴性对照和阳性对照设置 空白对照设为以水代替DNA模板； 阴性对照采用任意一种非目标菌 (李斯特菌ATCC 19119；普通变形杆菌ATCC 33420；金黄色葡萄球 菌ATCC 12600；小肠耶尔森菌ATCC 23715；大肠杆菌ATCC 11229；克雷伯氏菌ATCC 43086；粪肠球菌ATCC 14500；蜡样芽胞杆菌ATCC 11176 )的DNA作为PCR反应的模板； 3 DB22/T 1676—2012 阳性对照采用含有沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的DNA作为PCR 反应的模板。 9.3.3 多重 PCR 反应体系 反应体系和扩增参数：模板DNA 8 μL (4 种菌各2 μL) , 上、下游引物各8 μL ( 4 种引物各2 μL) , dNTP 4 μL (2.5 mmol/L) , Taq酶0.6 μL ( 5 U /μL)，10×Taq酶buffer 5 μL，MgCl2溶液5 μL，其余 用去离子水补足，总体积50 μL (参见附录C中C.2)。 9.3.4 多重 PCR 反应条件 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s ，72 ℃延伸45 s，依次进行30个循环，循环 结束后72 ℃延伸10 min。结束反应，4 ℃保存。 9.3.5 多重 PCR 扩增产物的电泳检测 用电泳缓冲液（1×TAE）制备2%琼脂糖凝胶（55 ℃～60 ℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 μg/mL）。 取8 μL～15 μL PCR扩增产物，分别和2 μL上样缓冲液混合，进行点样，用100 bp laddermarker作参 照。选用恒压3 V/cm～5 V/cm，电泳30 min～60 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。 10 结果判定和报告 在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未出现相应4条带 中任意一条大小一致的扩增条带，则可报告该样品检验结果为阴性；如待测样品出现预期扩增条带则可 判定该样品结果为假定阳性，则应按照GB 4789.4、GB 4789.7、GB 4789.30和SN/T 1022该致病菌对应 的标准检测方法进行确认，最终结果以后者的检测结果为准。