ICS 07.100.30 B 20 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2051—2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR 方法 Determination of Clostridium botulinum in feedstuffs PCR method 2014 - 02 - 28 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 04 - 30 实施 发 布 DB22/T 2051—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华 人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。 I DB22/T 2051—2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR 方法 1 范围 本标准规定了饲料中肉毒梭菌的PCR检验方法。 本标准适用于饲料中A、B、E、F型肉毒梭菌的快速筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 3 食品分子生物学检测 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肉毒梭菌 clostridium botulinum 肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一 类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。 4 原理 样品增菌后，培养物经DNA提取制备PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否 有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。 5 试剂 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。 5.1 引物：见表 1。 1 DB22/T 2051—2014 表1 引物序列 目标菌类型 A型 B型 E型 F型 引物序列 上游引物：5’-GTG ATA CAA CCA GAT GGT AGT TAT AG-3’ 下游引物：5’-AAA AAA CAA GTC CCA ATT ATT AAC TTT-3’ 上游引物：5’-GAG ATG TTT GTG AAT ATT ATG ATC CAG-3’ 下游引物：5’-GTT CAT GCA TTA ATA TCA AGG CTG G-3’ 上游引物：5’-CCA GGC GGT TGT CAA GAA TTT TAT-3’ 下游引物：5’-TCA AAT AAA TCA GGC TCT GCT CCC-3’ 上游引物：5’-GCT TCA TTA AAG AAC GGA AGC AGT GCT-3’ 下游引物：5’-GTG GCG CCT TTG TAC CTT TTC TAG G-3’ 扩增长度 bp 983 492 410 1 137 5.2 疱肉培养基：见附录 A.1 章。 5.3 胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGY）：见附录 A.2 章。 5.4 厌氧卵黄琼脂：见附录 A.3 章。 5.5 细菌基因组 DNA 提取纯化试剂盒。 5.6 Taq DNA 聚合酶。 5.7 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP （deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。 5.8 溶菌酶。 5.9 蛋白酶 K。 5.10 无水乙醇。 5.11 十二烷基硫酸钠（SDS）。 5.12 蔗糖。 5.13 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 5.14 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。 5.15 10×PCR 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾（KCl），15 mmol/L 氯化镁（MgCl2）。 5.16 分子量标记：100 bp~3 000 bp DNA Marker。 5.17 琼脂糖：电泳级。 5.18 溴化乙锭。 5.19 EDTA 溶液，0.5 mol/L，pH8.0：称取 186.1 g EDTA-Na2·2H2O，加入 700 mL 去离子水中，在磁 力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L 氢氧化钠调 pH 值至 8.0，用水定容到 1 L，分装后高压灭菌。 5.20 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在 800 mL 去离子水中溶解 121.1 g Tris，冷却至室温后用浓盐酸 调节溶液的 pH 值至 8.0，加水定容至 1 L，分装后高压灭菌。 5.21 TE 缓冲液（pH8.0）：在 800 mL 水中，依次加入 10 mL 的 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和 2 mL 的 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用水定容到 1 L，分装后高压灭菌。 5.22 溶菌酶溶液：用 TE 配制，使用浓度为 10 mg/mL。 5.23 蛋白酶 K 溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶 K 为 10 mg/mL 的溶液，分装后于-20 ℃保存， 避免反复冻融。 5.24 20% SDS 溶液：将 20 g SDS 溶解在 100 mL 去离子水中。 2 DB22/T 2051—2014 5.25 50×TAE 电泳缓冲液（储备液）：称取 484 g Tris，量取 114.2 mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH8.0），溶于水中，定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成 1×TAE 电泳缓冲液（工 作液）。 5.26 加样缓冲液：称取溴酚蓝 250 mg，加水 10 mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲腈蓝 250 mg， 用 10 mL 水溶解；称取蔗糖 50 g，用 30 mL 水溶解，合并三种溶液，用水定容至 100 mL，在 4 ℃保存。 5.27 阳性对照：含有扩增片段的质粒或 A、B、E、F 型肉毒梭菌的基因组 DNA。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 厌氧培养装置。 生物安全柜：AII 型。 恒温培养箱：35 ℃ ±1 ℃和 28 ℃±1 ℃。 高压灭菌器。 高速冷冻离心机：转速≥12 000 r/min。 PCR 仪。 电泳仪。 凝胶成像分析系统。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.10 6.11 6.12 6.13 6.14 7 恒温水浴锅。 天平：感量 0.1 g。 均质器或灭菌研钵。 微量移液器：0.2 μL ～2 μL、2 μL～10 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL。 离心管：1.5 mL。 检测 7.1 样品制备与增菌培养 样品经均质处理后及时接种培养。接种前，先将增菌培养基煮沸 10 min~15 min，以排除溶解于培 养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇动。每 15 mL 增菌肉汤中接种 1 g~2 g 样品，接种时将接种物慢慢接 入肉汤液面以下。每份样品接种两管疱肉培养基，置 35 ℃±1 ℃，同时接种两管 TPGY 培养基，置 28 ℃±1 ℃，厌氧培养 5 d。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长，按 7.2 分离纯培 养物。若未见生长，可再培养 10 d。 7.2 分离纯培养物 取1 mL～2 mL培养液置于螺旋帽试管中，加入等量过滤除菌的无水乙醇。混匀，在室温下放置1 h。 或80 ℃加热10 min～15 min以破坏其繁殖体。 用接种环取1环～2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下35 ℃±1 ℃培养48 h。 挑取约10个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不规 则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。彩带通常向外延伸， 继而菌落产生不规则外形。 接种可疑菌落到TPGY培养基中，置35 ℃±1 ℃厌氧培养24 h。 3 DB22/T 2051—2014 培养液一部分用于DNA提取，剩余培养液置于4 ℃保存，以备确证试验使用。 7.3 DNA 提取 取1.4 mL TPGY培养物转移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液。菌体沉淀用 1.0 mL TE缓冲液洗两次后重悬于120 μL的25%蔗糖溶液中。加入10 mg/mL溶菌酶溶液120 μL，混匀， 37 ℃±1 ℃水浴30 min；然后加入20% SDS溶液30 μL，轻轻混匀，室温放置5 min；再加入10 mg/mL蛋 白酶K溶液9.0 μL，混匀后37 ℃±1 ℃水浴30 min。悬浮液采用细菌基因组DNA提取纯化试剂盒并按试剂 盒说明书进行操作。提取的DNA溶液可于-20 ℃保存。 7.4 DNA 浓度测定 取10 μL DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩 增前将所有样品DNA调至10 ng/μL～50 ng/μL。 c= A ´ N ´ 50 .............................................................................................(1) 1000 式中： c—— DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μ L）； A—— 260 nm处的吸光值； N—— 核酸稀释倍数。 7.5 PCR 检验 7.5.1 PCR 反应体系 10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、Taq DNA聚合 酶 (5 U/μL) 0.25 μL、DNA 模板（10 ng/μL～50 ng/μL）2 μL、用无菌去离子水补足体积至25 μL。 针对A、B、E、F型肉毒梭菌，进行多个PCR扩增，每个PCR反应管检测一种类型的肉毒梭菌。 7.