ICS 65.120 B 04 备案号：35745-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1617—2012 饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和 隐色结晶紫的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of malachite green、leucomalachite green、crystal violet and leucocrystal violet in feeds——HPLC-MS/MS method 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1617—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、珲春出入境检验检疫局技术中心、白 城出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：康明芹、张琦、张勋、冯博、孟日增、杨帆、张代辉、胡婷婷。 I DB22/T 1617—2012 饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的液相色谱-质谱/质谱测定方 法。 本标准适用于饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 试样经乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，二氯甲烷和水液液萃取，再经中性氧化铝固相萃取小柱净化，液 相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 无水乙酸铵(CH3COONH4)：优级纯。 4.2 盐酸羟胺(HONH3Cl )。 4.3 对-甲苯磺酸（C7H8O3S）。 4.4 标准物质：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫（LCV）纯度均≥ 98%。标准物质信息参见附录 A。 4.5 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.6 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 4.7 二氯甲烷（CH2 Cl2）：优级纯。 4.8 冰醋酸（ CH3 COOH）：优级纯。 4.9 0.1 mol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 1.54 g 无水乙酸铵溶解于 200 mL 水中，混匀，并用冰醋酸调 pH 值到 4.5。 1 DB22/T 1617—2012 4.10 0.25 g/mL 盐酸羟胺溶液：称取 25.0 g 盐酸羟胺，用水溶解并定容至 100 mL。 4.11 1.0 mol/L 对-甲苯磺酸溶液：称取 17.2 g 对-甲苯磺酸，用水溶解并定容至 100 mL。 4.12 0.1%甲酸溶液：取 1.0mL 甲酸(4.6)，用水稀释并定容至 1 000 mL。 4.13 样品定容液：乙腈-0.1%甲酸溶液(8+2)。 量取 80 mL 乙腈(4.5)与 20 mL 的 0.1%甲酸溶液(4.12)， 混匀。 4.14 标准储备液：0.1 mg/mL。准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准 物质（4.4），分别用少量乙腈溶解并转移至 100 mL 容量瓶中，分别用乙腈定容至刻度，混匀。 4.15 标准工作液：10.0 μg/L。首先分别准确吸取上述四种硝基呋喃代谢物标准储备液（4.14）用乙腈 稀释成 1.0 mg/L 的溶液，然后从中准确吸取 1.0 mL 于 100 mL 容量瓶中，用样品定容液稀释并定容至 刻度，混匀。 4.16 中性氧化铝固相萃取小柱：500 mg/6 mL，使用前用 10 mL 乙腈预处理。 4.17 滤膜：0.22 µm，有机系。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 5.2 高速匀浆机。 5.3 旋转蒸发仪。 5.4 天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 5.5 高速离心机：10 000 r/min。 5.6 涡旋混合器。 5.7 聚丙烯离心管：50 mL。 5.8 超声波清洗器：40 kHz。 5.9 0.28 mm 孔筛。 6 试样制备 取有代表性样品，粉碎，过 0.28 mm 筛，混匀备用。 7 测定步骤 7.1 提取 称取2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，依次加入1 mL乙酸铵缓冲溶液（4.9）、1 mL盐酸 羟胺溶液（4.10）、1 mL对-甲苯磺酸溶液（4.11）和24 mL乙腈，高速匀浆2 min，10 000 r/min离心4 min， 将上清液转移至500 mL分液漏斗中。剩余残渣用20 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。于分液漏斗中 2 DB22/T 1617—2012 加入30 mL二氯甲烷、20 mL水，振摇2 min，静止分层，收集下层有机相于250 mL浓缩瓶中，再用20 mL 二氯甲烷重复萃取一次，合并下层有机相，40 ℃旋转蒸发至近干。 7.2 净化 将上述浓缩瓶中残渣用10 mL乙腈分三次（每次约3 mL）超声溶解，并依次通过预处理过的中性氧 化铝固相萃取小柱（4.16），收集洗脱液。再用20 mL乙腈分四次进行洗脱，合并洗脱液于鸡心瓶中， 40 ℃旋转蒸发至干，用乙腈-0.1%甲酸溶液（4.13）定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，滤液供LC-MS/MS测 定。 7.3 混合基质标准溶液的制备 称取7份2 g（精确至0.01 g）阴性试样于50 mL离心管中，操作同7.1和7.2至“……用乙腈-0.1%甲酸 溶液（4.12）定容至1 mL，过0.22 μm滤膜”后分别加入少量标准溶液使浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、 20.0、50.0、100.0 μg /L，供LC-MS/MS测定。 7.4 空白试验 除不称取试样外，均按 7.1、7.2 进行。 7.5 测定 7.5.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) b) c) d) e) 色谱柱：C18，2.1mm×150 mm，3.5 μm； 柱温：室温； 流速：0.25 mL/min； 进样量：10 μL； 流动相：乙腈-0.1 %甲酸溶液（8+2）。 7.5.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) d) e) f) g) h) i) j) 检测方式：多反应监测（MRM）； 电离电压：3 kV~5 kV； 脱溶剂气：0.21 MPa； 雾化气：0.24 MPa； 辅助气：0.35 MPa； 碰撞气：0.15 MPa； 离子源温度：300 ℃~550.0 ℃； 定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表 1。 3 DB22/T 1617—2012 表1 目标化合物的监测离子对、去簇电压和碰撞能量 化合物名称 母离子 子离子 去簇电压 碰撞能量 m/z m/z V V 208 80 52 孔雀石绿 329 隐色孔雀石绿 331 结晶紫 372 隐色结晶紫 374 313* 80 48 239* 80 47 315 80 44 340 80 70 356* 80 52 239 80 47 358* 80 44 注：带“*”的为定量离子。 7.5.3 定性分析 在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时 间与标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对 丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对标准偏差不超过表2规定的范围，则 可判定样品中存在该物质。标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.5.4 定量测定 根据试样中被测样液中被测组分的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行分析，对于高浓度 样品须适当进行系列稀释。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述 色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的参考保留时间为4.43 min~7.43 min，外 标法定量。标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B。 8 结果计算和表述 按（1）式计算试样中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫残留量含量，计算结果需扣 除空白值。 Xi = ci ´ V m ..............................................(1) 式中： X i —— 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克 (μg/kg)； ci —— 从标准曲线读出的被测组分溶液浓度，单位为微克每升（μg/L） ； V —— 样液最终定容体积，单位为毫升 (mL)； 4 DB22/T 1617—2012 m ——样液所代表的最终试样的质量，单位为克 (g)。 计算结果表示到小数点后一位。 9 定量限、回收率和精密度 9.1 定量限 本标准方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的定量限均为0.5 μg/kg。 9.2 回收率及精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定结果的算术平均值的15 %。 样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的添加浓度及其回收率、精密度实验数据参 见附录C。 5 DB22/T 1617—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 标准物质信息 表A.1 标准物质 CAS 号、分子式及分子量 6 化合物名称 CAS号 分子式 分子量 孔雀石绿草酸盐 2437-29-8 C52H54N4O12 927.01 隐色孔雀石绿 129-73-7 C23H26N2 330.47 结晶紫盐酸盐 548-62-9 C25H30N3Cl 407.98 隐色结晶紫 603-48-5 C25H31N3 373.53 DB22/T 1617—2012 BB 附 录 B （资料性附录） 标准溶液多反应监测（MRM）色谱图 图B.1 标准溶液多反应监测（MRM）色谱图（4