ICS 65.020 B16 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1280—2012 大豆疫霉菌分子检测技术规程 Standard protocol for molecular detection of Phytophthora sojae 2012 - 11 - 02 发布 福建省质量技术监督局 2013 - 02 - 01 实施 发 布 福 建 省 地 方 标 准 大豆疫霉菌分子检测技术规程 DB35/T 1280—2012 * 2013 年 1 月第一版 2013 年 1 月第一次印刷 DB35/T 1280—2012 目 次 前言 ............................................................................... III 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 材料与试剂 ........................................................................ 1 5.1 主要仪器与器材 ................................................................ 5.1.1 PCR 检测仪................................................................. 5.1.2 凝胶成像仪 ................................................................ 5.1.3 台式离心机 ................................................................ 5.1.4 涡旋混匀器 ................................................................ 5.1.5 电泳仪 .................................................................... 5.2 主要试剂 ...................................................................... 5.2.1 苯酚；氯仿；异戊醇；乙醇 .................................................. 5.2.2 二甲基亚砜 ................................................................ 5.2.3 氢氧化钠 .................................................................. 5.2.4 脱脂奶粉 .................................................................. 5.2.5 PCR 常规试剂 ............................................................... 6 采样 .............................................................................. 2 6.1 采样工具 ...................................................................... 6.2 样品采集 ...................................................................... 6.2.1 大豆植株 .................................................................. 6.2.2 土壤 ...................................................................... 6.3 样品贮运 ...................................................................... 6.4 样品存放 ...................................................................... 7 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 操作方法 .......................................................................... 2 7.1 样本 DNA 制备 .................................................................. 7.1.1 植物组织中病原菌 DNA 的提取 ................................................ 7.1.2 土壤中 DNA 的提取 .......................................................... 7.1.3 DNA 的保存................................................................. 7.2 检测 .......................................................................... 7.2.1 加样 ...................................................................... 7.2.2 PCR 检测................................................................... 7.2.2.1 反应体系 ................................................................ 7.2.2.2 反应条件 ................................................................ 2 2 3 3 3 3 3 3 3 I DB35/T 1280—2012 7.2.3 套式 PCR 检测 ............................................................... 3 7.2.3.1 套式 PCR 模板 DNA 制备 .................................................... 3 7.2.3.2 套式 PCR 反应体系 ........................................................ 3 7.2.3.3 套式 PCR 反应条件 ........................................................ 4 7.3 琼脂糖凝胶电泳 ................................................................. 4 8 结果判定 ........................................................................... 4 8.1 PCR 检测结果判定 ............................................................... 4 8.2 套式 PCR 结果判定 ............................................................... 4 9 样品处理 ........................................................................... 4 附录 A（资料性附录） 大豆疫霉菌样本检测报告........................................... 5 附录 B（资料性附录） 大豆疫霉 PCR 检测试剂............................................. 6 II DB35/T 1280—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的要求编写。 本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：陈庆河、翁启勇、李本金、兰成忠、赵健、邱荣洲。 III DB35/T 1280—2012 大豆疫霉菌分子检测技术规程 1 范围 本标准规定了大豆疫霉菌PCR检测的样品制备、检测技术和操作程序。 本标准适用于大豆植物组织及土壤中大豆疫霉菌的分子检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 巢式 PCR（nested PCR） 是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩 增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增 多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性，又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的特异 性。 3 原理 大豆