ICS 65.020.20 B16 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1575—2016 水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程 2016 - 04 - 06 发布 福建省质量技术监督局 2016 - 07 - 06 实施 发 布 福 建 省 地 方 标 准 水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程 DB35/T 1575—2016 * 2016 年 7 月第一版 2016 年 7 月第一次印刷 DB35/T 1575—2016 目  次 前  言............................................................................................................................................................. II 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 标本的采集与保存......................................................................................................................................... 1 3 分离技术......................................................................................................................................................... 1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 培养基的配制......................................................................................................................................... 1 稻曲球消毒............................................................................................................................................. 1 稻曲球捣碎液制备................................................................................................................................. 1 稻曲球捣碎液涂布平板......................................................................................................................... 1 分离纯化................................................................................................................................................. 2 形态学鉴定............................................................................................................................................. 2 保存......................................................................................................................................................... 2 4 分子鉴定......................................................................................................................................................... 2 4.1 4.2 4.3 4.4 稻曲病菌 DNA 制备................................................................................................................................. 2 PCR 检测.................................................................................................................................................. 2 琼脂糖凝胶电泳..................................................................................................................................... 2 PCR 鉴定结果.......................................................................................................................................... 2 附录 A（规范性附录） 水稻稻曲病标本特征............................................................................................... 3 附录 B（资料性附录） 水稻稻曲病菌小菌落特征....................................................................................... 4 附录 C（规范性附录） 水稻稻曲病菌形态学特征....................................................................................... 5 附录 D（资料性附录） 稻曲病菌 PCR 鉴定结果........................................................................................... 6 I DB35/T 1575—2016 前  言 本标准按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所、福建省农业科学院水稻研究所。 本标准主要起草人：陈福如、石妞妞、郑长林、杜宜新、杨秀娟、阮宏椿、甘林。 II DB35/T 1575—2016 水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了水稻稻曲病菌[Ustilaginoidea virens（Cooke）Tak.]标本的采集和保存、水稻稻曲 病菌的分离技术和鉴定技术。 本标准适用于对水稻稻曲病菌的分离、鉴定。 2 标本的采集与保存 于水稻成熟期从田间剪取有黄色稻曲球的稻穗，其症状特征见附录A；按单个稻穗装入牛皮纸袋， 贴上标签，注明采集时间、地点和水稻品种，带回实验室分离或于4 ℃冰箱保存（保存时间不超过60 d） 。 3 分离技术 3.1 培养基的配制 胁本哲氏培养基：将去皮马铃薯300 g切成小块，加水1 000 mL煮沸25 min， 用四层纱布过滤，过 滤 液 中 加 入 琼 脂 16 g ， 待 琼 脂 完 全 融 化 后 加 入 蛋 白 胨 5 g 、 蔗 糖 15 g 、 Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g 、 Na2HPO4·12H2O 2 g，加水定容至1 000 mL，在121 ℃下湿热灭菌25 min。 4 -1 抑制细菌生长的胁本哲氏培养基：待培养基冷却至60 ℃左右加入配置好的1×10 μg·mL 氯霉素母 -1 液，使其终浓度为50 μg·mL 。 马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：将去皮马铃薯200 g切成小块，加水1 000 mL煮沸25 min, 用四层纱 布过滤，过滤液中加入琼脂16 g，待琼脂完全融化后加入蔗糖 20 g，加水定容至1 000 mL，在121 ℃ 下湿热灭菌25 min。 马铃薯蔗糖培养液（PS）：将去皮马铃薯200 g切成小块，加水1 000 mL煮沸25 min, 用四层纱布 过滤，过滤液中加入蔗糖 20 g，加水定容至1 000 mL，在121 ℃下湿热灭菌25 min。 3.2 稻曲球消毒 用无菌手术刀刮除稻曲球外表层的杂菌，用无菌水冲洗，再用75%的乙醇溶液消毒30 s，5%次氯酸 钠水溶液消毒3 min，无菌水清洗3次。 3.3 稻曲球捣碎液制备 将消毒好的单粒稻曲球放入无菌培养皿中，加入4 mL无菌水，用无菌手术刀捣碎稻曲球组织后，制 备含厚垣孢子和菌丝组织碎块的稻曲球捣碎液。 3.4 稻曲球捣碎液涂布平板 用移液枪吸取0.2 mL捣碎液涂布于抑制细菌生长的胁本哲氏培养基表面。 3.5 分离纯化 1 DB35/T 1575—2016 无菌通风条件下风干培养基表面后，将培养皿倒置于恒温箱中，28 ℃黑暗培养8 d后，选取质地致 密、直径2 mm～3 mm 的黄色或白色小菌落(其特征参见附录B)，用接种针从菌落边缘挑取菌丝块移至胁 本哲氏培养基中培养10 d。 3.6 形态学鉴定 在显微镜