ICS 65.020.01 B16 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1555—2016 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒 多重 RT-PCR 检测方法 Multiplex RT-PCR Method of Narcissus yellow stripe virus, Narcissus mosaic virus and Narcissus latent virus 2016 - 04 - 06 发布 福建省质量技术监督局 2016 - 07 - 06 实施 发 布 DB35/T 1555—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》给出的规则编写。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人：沈建国、高芳銮、金晶、李敏、虞赟、陈细红、陈寿铃。 I DB35/T 1555—2016 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒 多重 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的多重RT-PCR检测方法。 本标准适用于水仙鳞球茎、植株中水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的多重RT-PCR检测。 2 规范性文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3 有害生物基本信息 参见附录A。 4 原理 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒分子生物学特性是多重RT-PCR检测的主要依据。 5 5.1 仪器设备和主要试剂 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平（1/1000 g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20 ℃低温冰箱和-80 ℃ 超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台 等。 5.2 主要试剂 多重RT-PCR检测试剂见附录B。 6 6.1 抽样和样品制备 抽样 抽样方法按照SN/T 2122中规定执行，尽可能抽取有病毒危害症状的材料，水仙黄条病毒、水仙花 叶病毒和水仙潜隐病毒的危害症状描述参见附录A。 1 DB35/T 1555—2016 6.2 样品制备 分别按照有症状和无症状进行样品制备，具体方法按照SN/T 2964和SN/T 3457中规定执行。 7 多重 RT-PCR 具体方法见附录B。 8 序列测定 PCR产物纯化、回收后，进行克隆、测序，或者直接测序。利用美国国立生物技术信息中心（NCBI） 网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知的相应病毒序列进行比对，同源性达到95%以上， 则判定为该病毒序列。 9 结果判定 9.1 9.2 9.3 9.4 10 当 RT-PCR 检测结果呈阳性，测定的序列为水仙黄条病毒序列，则判定为检出水仙黄条病毒。 当 RT-PCR 检测结果呈阳性，测定的序列为水仙花叶病毒序列，则判定为检出水仙花叶病毒。 当 RT-PCR 检测结果呈阳性，测定的序列为水仙潜隐病毒序列，则判定为检出水仙潜隐病毒。 当 RT-PCR 检测结果呈阴性，则判定为未检出对应目的条带大小的病毒。 结果判样品保存 经检测，结果判定为阳性的样品应保存在-20 ℃或-80 ℃冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复 核用。 11 记录 记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经 手人和实验人员的签字。分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。 2 DB35/T 1555—2016 附 录 A （资料性附录） 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒的背景资料 A.1 分类地位 水仙黄条病毒： 学名：Narcissus yellow stripe virus，缩写：NYSV。 分类地位：马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）、马铃薯 Y 病毒属 (Potyvirus)。 水仙花叶病毒： 学名：Narcissus mosaic virus，缩写：NMV。 分类地位：线性病毒科（Flexiviridae）、马铃薯 X 病毒属（Potexvirus）。 水仙潜隐病毒： 学名：Narcissus latent virus，缩写：NLV。 分类地位：马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）、柘橙病毒属（Macluravirus）。 A.2 寄主范围 NYSV：自然寄主目前已报道的主要为水仙属（Narcissus spp.）的水仙。 NMV：自然寄主目前已报道的主要为黄水仙（Narcissus pseudonarcissus）。 NLV：自然寄主目前已报道的主要为黄水仙（Narcissus pseudonarcissus） 、鸢尾（Iris xiphium） 、 剑兰（Gladiolus hybrids）、根希百合（Nerine sarniensis） 。 A.3 病害症状 NYSV：典型症状为沿叶脉产生褪绿黄色条斑，系统花叶，病叶表面有凸起，花梗产生褪绿斑，病株 花朵着色不均，最后导致鳞茎变小、植株矮化，直至提前枯萎。 NMV：初期无症状或叶片上部仅有轻微的不规则褪绿小斑，但随着病情加重，病斑表现明显的花叶， 并扩展为较大的斑块。发病严重时，引起叶片扭曲、黄化，植株矮小畸形，鳞茎变小，种球退化。 NLV：单独侵染水仙后引起叶片顶端产生褪绿黄色条斑，与其他病毒复合侵染时导致水仙植株出现 花叶、斑驳、黄化、坏死、花箭减少、香味变淡以及矮化畸形等症状。 A.4 分布地区 NYSV：主要分布于英国、荷兰、立陶宛、美国、新西兰、中国。 NMV：主要分布于英国、荷兰、中国。 NLV：主要分布于英国、荷兰、德国、意大利、以色列、澳大利亚、中国。 A.5 传播途径 NYSV：汁液接触、蚜虫传播。 NMV：汁液接触。 NLV：汁液接触、蚜虫传播。 3 DB35/T 1555—2016 A.6 粒体形态 NYSV：病毒粒体为线条状，大小约 755 nm×12 nm，粒体形态见图 A.1。 NMV：病毒粒体为线条状，大小约 550 nm×13 nm，粒体形态见图 A.2。 NLV：病毒粒体为线状，大小约 650 nm×13 nm，粒体形态见图 A.3。 注：引自http://www.dpvweb.net 图A.1 A.7 NYSV 病毒粒体 注：引自http://www.dpvweb.net 图 A.2 NMV 病毒粒体 病毒基因组 NYSV：正义单链 RNA 病毒，全长约 9650 bp。 NMV：正义单链 RNA 病毒，全长约 6955 bp。 NLV：正义单链 RNA 病毒，全长尚未见报道。 4 注：引自http://www.dpvweb.net 图 A.3 NLV 病毒粒体 DB35/T 1555—2016 附录 B （规范性附录） 多重 RT-PCR 检测方法 B.1 试剂 B.1.1 TrizoL裂解液 B.1.2 5xTBE缓冲液 Tris碱 54.0 g 硼酸 27.5 g 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL 补充蒸馏水至1 L B.2 实验步骤 B.2.1 总RNA提取 称取0.1 g待检样品，用液氮研磨成粉末状，迅速转移至灭菌的1.5 mL离心管中，并加入1 mL TrizoL 裂解液，剧烈振荡后，室温静置5 min；4 ℃，12000 g离心10 min，取上清；加入氯仿200 μL，剧烈 震荡15 s，室温静置3 min，4 ℃，12000 g离心15 min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混 匀后室温下静置5 min，4 ℃，12000 g离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次 4 ℃，7500 g离心5 min，弃上清；RNA沉淀干燥后，用20 μL～40 μL经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理 过的双蒸水（ddH2O）溶解，-20 ℃保存备用。 B.2.2 RT-PCR反应 B.2.2.1 引物序列 表 B.1 引物序列 病毒名称 水仙黄条病毒 水仙花叶病毒 水仙潜隐病毒 引物序列 NYSV-f：5´-AAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3´ NYSV-r：5´-CCATCCAGCCCAAATAAG-3´ NMV-f：5´-CGCTCGACAGTTTTACGT-3´ NMV-r：5´-TCTGGAGGTGCTTCAATG-3´ NLV-f：5´-GATGCGACTGCTCAAGGC-3´ NLV-r：5´-CAGGCTGTCATTTGCTTACC-3´ 目的条带大小 668 bp 372 bp 554 bp B.2.2.2 cDNA合成 5 DB35/T 1555—2016 在PCR管中加入3 μL总RNA，0.5 μL 各病毒下游引物，95 ℃水浴7 min，迅速冰浴5 min，再加入 5×RT 缓冲液2.5 μL、dNTP（10 mmol/L）0.5 μL、M-MLVRT(200 U/μL) 0.5 μL、RNasin(40 U/μL)0.5 μL和ddH2O 2.5 μL。37 ℃水浴60 min，95 ℃水浴10 min，自然冷却至室温，-20 ℃保存备用。 B.2.2.3 PCR扩增 PCR反应体系见表B.2，每个反应设置2个重复。检测时以含有各病毒目标片段的质粒或含病毒材料 作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。 PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性45 s、50 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，35个循 环，最后一个循环结束后72 ℃继续延伸10 min。 表 B.2 PCR 反应体系 名称 加样量/μL 反转录产物 3.0 Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 dNTPs (10 mmol/L) 0.5 10 ×PCR 缓冲液 (Mg2+ Free) 2.5 MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 NYSV-f (10 μmol/μL) 1.2 NYSV-r (10 μmol/μL) 1.2 NMV-f (10 μmol/μL) 0.8 NMV-r (10 μmol/μL) 0.8 NLV-f (10 μmol/μL) 0.5 NLV-r (10 μmol/μL) 0.5