ICS 65.020.01 B 39 DB61 陕 西 省 地 方 标 准 DB 61/T 1158.4—2018 桑黄标准综合体 第 4 部分：液体菌种生产技术规程 Integrated Standards of Phellinus spp.— Part 4：Technical Rules for Liquid Inoculum Preparation 2018 - 05 - 01 发布 陕西省质量技术监督局 2018 - 06 - 01 实施 发 布 DB61/T 1158.4—2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 栽培场地 .......................................................................... 1 4 栽培环境 .......................................................................... 1 5 栽培设施 .......................................................................... 2 附录A（规范性附录） 食用菌生产场所处理方法 .......................................... 3 I DB61/T 1158.4—2018 前 言 DB61/T 1158—2018《桑黄标准综合体》分为六个部分： ——第 1 部分：生产环境； ——第 2 部分：菌种； ——第 3 部分：菌种生产技术规程； ——第 4 部分：液体菌种生产技术规程； ——第 5 部分：桑黄栽培技术规程； ——第 6 部分：子实体干品质量要求。 本部分为 DB61/T 1158—2018 的第 4 部分。 本部分按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本部分由陕西省农业厅提出并归口。 本部分起草单位：陕西省微生物研究所、杨凌康宇生物科技有限公司、陕西省园艺蚕桑工作站。 本部分主要起草人：雷萍、吴亚召、张文隽、渠敬峰、王周平、张伟兵、霍国琴、赵玉鹏、马莹、 杜艳。 本部分由陕西省微生物研究所负责解释。 本部分首次发布。 联系信息如下： 单位：陕西省微生物研究所 地址：西安市雁塔区西影路 76 号 邮编：710043 电话：029-82357027 II DB61/T 1158.4—2018 桑黄标准综合体 第 4 部分：液体菌种生产技术规程 1 范围 DB61/T 1158 的本部分规定了桑黄液体菌种的生产条件、生产工艺及标签、贮存。 本部分适用于袋料栽培的桑黄液体菌种生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 5749 生活饮用水卫生标准 NY/T 528食用菌菌种生产技术规程 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 DB61/T 1158.3 桑黄标准综合体 第3部分：菌种生产技术规程 《食用菌菌种管理办法》中华人民共和国农业部第62号令（2006年3月27日） 3 生产条件 3.1 技术人员 按照《食用菌菌种管理办法》的规定配备菌种生产的专业技术人员。 3.2 生产场地 3.2.1 地势干燥、空气优良、通风良好、水源充足且符合 GB 5749 生活饮用水卫生标准、排水畅通、 交通便利，电源充足，有硬质路面排水良好的道路。 3.2.2 环境卫生应符合 NY/T 528 的规定。300m 之内无禽畜舍，无垃圾场，无污水、粉尘污染源。 3.3 生产厂房 3.3.1 3.3.1.1 统。 3.3.1.2 3.3.2 液体菌种生产车间 地面应防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，应有 1.0%～1.5%的排水坡度和良好的排水系 墙壁和天花板应具有防潮、防霉、防水功能，且易清洗；电力满足生产要求，通风良好。 液体菌种接种间 3.3.2.1 应设置缓冲间及与接种人数相适应的更衣室。 3.3.2.2 车间入口处设置洗手、消毒和干手设备。放置封闭式废物桶，安装排风设备，门窗应安装防 蚊蝇纱网。 1 DB61/T 1158.4—2018 3.3.3 发酵室 内壁和房顶光滑易清洗和消毒。 3.4 设施设备 按照DB61/T 1158.3中3.3要求配备。 3.5 培养基质 应符合NY 5099无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求的规定。 4 生产工艺 4.1 工艺流程 母种→摇瓶种制备→种子罐菌种制备→液体菌种发酵→菌种检测。 4.2 摇瓶种制备 4.2.1 培养基 按照附录A规定配制。 4.2.2 装液量 采用500mL的常规三角瓶，每瓶装量为100mL～150mL，八层纱布和牛皮纸封口。 4.2.3 灭菌 在121℃～126℃，0.14MPa～0.17MPa的压力下，保持30分钟。 4.2.4 接种 2 2 将灭菌后的培养基冷却至30℃以下，无菌条件下每瓶接入0.3cm ～0.5cm 母种1块。 4.2.5 培养 （27±1）℃静止培养24h后，移至摇床130r/min～150r/min振荡频率下培养48h，再调至150r/min～ 180r/min，继续培养72h～96h。 4.2.6 4.2.6.1 4.2.6.2 4.2.6.3 4.2.6.4 4.3 移种标准 菌体形态：桑黄菌丝长分支，发酵液清香，颜色清亮、浅褐色，菌丝球多，菌液稍有黏稠。 菌丝量：10%～15%（湿重）。 酸碱度：发酵液 pH5.0～5.5。 镜检：平皿检验无杂菌。 种子罐菌种制备 4.3.1 培养基 按照附录A规定配制。 2 DB61/T 1158.4—2018 4.3.2 装液量 发酵罐体积的60%。 4.3.3 灭菌 用夹层预热培养基至80℃后，蒸汽进罐升温至121℃～124℃，0.11MPa～0.14MPa保压恒温40min。 4.3.4 接种 在无菌条件下接种，接种量为10%～15%；接种后调节进、排气阀，使罐压保持在0.02MPa～0.04MPa 之间。 4.3.5 培养 搅拌转速120r/min～150r/min，温度（27±1）℃培养120h。定时用肉汤培养基（按照附录C规定配 制）检查发酵液的无菌情况，显微镜检查菌体的状况。 每隔8h或12h取样液进行一次无菌检验。用2支肉汤试管及1只培养皿（培养基按照附录D规定配制） 同时检验。肉汤连续3次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混浊，平板培养连续3次有杂菌菌落出 现为染菌。肉汤阳性反应不明显，发酵液各项参数表明确有可疑的染菌反应，经镜检证实有杂菌存在， 也应判断为染菌。 4.4 液体菌种发酵 4.4.1 4.4.1.1 4.4.1.2 4.4.2 液体培养基制作 按照附录 B 规定配制。水质应符合 GB 5749 的规定。 灭菌按照发酵罐厂家型号使用说明书的要求进行操作。 菌种接入罐体 在无菌条件下接种，接种量为10%～15%。 4.4.3 液体菌种培养 罐温：（28±2）℃。 5 罐压：（0.3～0.4）×10 Pa 。 通气量：1︰0.5V/V·min。 搅拌速度：150r/min～180r/min。 培养时间：96h～120h。 4.5 液体菌种检测 接种后第 4 d 进行检测，按照无菌操作取样，将样液接于 GB 4789.28 规定的试管斜面或培养皿的 培养基上，（28±2） ℃培养 2 d～5 d，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况。若无细菌、霉菌等杂菌 菌落生长，则表明该样品无杂菌污染。 5 液体菌种合格指标 5.1 感官指标 3 DB61/T 1158.4—2018 5.1.1 菌丝形态与色泽：具有“毛刺”的球状菌丝体呈米白色，菌液呈棕色。 5.1.2 菌液形态：菌液稍粘稠，有大量菌丝体悬浮、分布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球 间液体不浑浊。 5.1.3 菌液气味：有桑黄菌液体培养时特有的香气，无酸、臭味等，培养器排气口气味正常。 5.2 理化指标 5.2.1 酸碱度：pH 值 5.5～6.0。 5.2.2 菌丝量：菌丝湿重（g/L）≥80。 5.2.3 菌丝形态和杂菌鉴别：显微镜下可见桑黄菌种液体培养中特有的菌丝形态，初始阶段菌丝壁薄， 黄绿色透明，顶端钝圆，有一主干，极少分支，具不明显的简单分隔，原生质丰富，直径 0.3µm～1µm。 老熟菌丝隔膜处常隆起，骨棒状，菌丝分支处偶有直角分支。深层发酵培养菌丝体大量分布，菌丝缠绕 结成球状，表面有凸起的菌刺，菌刺形状分支较多。菌丝无锁状联合。无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。 6 标签、贮存 6.1 标签 生产的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。 6.2 贮存 6.2.1 摇瓶种保存 4℃、暗光条件下可保存5d～7d。 6.2.2 种子罐液体菌种保存 15℃～20℃可保存1d～2d。 4 DB61/T 1158.4—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 常用摇瓶种培养基 A.1 常用摇瓶种培养基 A.1.1 葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%， pH值6.0。玉米粉，豆饼粉均过80目筛。 A.1.2 可溶性淀粉3%～6%，白砂糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，pH值6.0。 5 DB61/T 1158.4—2018 BB 附 录 B （规范性附录） 常用发酵罐培养基 B.1 常用发酵罐培养基 B.1.1 葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%， pH值6.0。玉米粉，豆饼粉均过80目筛。 B.1.2 可溶性淀粉3%～6%，白砂