ICS 65.020.20 CCS B 61 34 安徽省 地方标准 DB34/T 4625—2023 石榴脱毒苗木繁育技术规程 Technical regulations for virus -eliminated tissue culture seedling propagation of pomegranate 2023 - 10 - 07发布 2023 - 11 - 07实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 4625 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽中以农业科技有限公司提出。 本文件由安徽省林业局归口。 本文件起草单位： 安徽中以农业科技有限公司、 安徽科技学院、 安徽省中以智农众创空间有限公司、 安徽省红玛瑙石榴科技有限公司、安徽省质量和标准化研究院。 本文件主要起草人： 钱晶晶、葛伟强、马纪忠、洪少民、胡能兵、杨友婷、崔广荣、 姚登波、 洪登 华、王宁、吕群龙、杨小元、韩啸。 DB34/T 4625 —2023 1 石榴脱毒苗木繁育技术规程 1 范围 本文件规定了石榴脱毒苗木组培生产过程的术语和定义、环境要求、组培技术、病毒检测和质量要 求。 本文件适用于果用、观赏石榴品种的脱毒苗木繁育。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 6000 主要造林树种苗木质量分级 GB/T 8321 （所有部分） 农药合理使用准则 LY/T 1893 石榴苗木培育技术规程 DB34/T 3410 石榴生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 外植体 explants 植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段 。 3.2 石榴组培 tissue culture of pomegranates 利用石榴茎尖等组织作为外植体，在无菌条件下通过人工培育出完整植株的过程。 3.3 茎尖脱毒 virus-eliminated of plant shoot tip 采用茎尖接种的离体培养方式，达到脱除植物病毒的目的。 3.4 褐化 browning 培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，影响培养物的生长、分化，甚至死 亡的现象。 4 环境要求 操作间要求由准备室、缓冲室、接种室、培养室、炼苗室和移栽温室等部分组成 。其中接种室、培 养室需要严格无菌，所处环境要求具备可以自动杀菌、控温、控光等条件。 DB34/T 4625 —2023 2 准备室 4.1 用于药品和培养基配置、器具洗涤及灭菌等， 面积≥15 m2，温度为 20℃～28℃。 缓冲室 4.2 用于室外与接种室或培养室 的隔离缓冲区间，应具 备换衣区、风淋区，面积≥ 2 m2。 接种室 4.3 单间接种室面积≥ 10 m2，高度≤ 3 m；接种室要求严格无菌，应具备超净工作台，室内应吊装紫外 线灭菌灯，距离地面 1 m 处，其辐射强度应＞ 70 W·cm-2；2 d～3 d 进行1次紫外消杀灭菌， 1月～2 月进行 1 次甲醛熏蒸消杀灭菌处理；室内温度 21℃～26℃，相对湿度 50%～70%。 培养室 4.4 用于组培苗的培养，面积≤ 50 m2，方便隔离和消杀；培养室要求严格无菌，应具备培养架，室内 应吊装紫外线灭菌灯，距离地面 1 m 处，其辐射强度应＞ 70 W·cm-2；1 月～2 月进行 1 次甲醛熏蒸 消杀灭菌处理；培养室环境相对湿度 70%～80%；光培养 16 h，22℃～26℃，光照强度 2000 Lux～5000 Lux；暗培养 8 h，22℃～26℃。 炼苗室 4.5 应具有自动喷雾或加湿设施，温度 22℃～28℃、相对湿 度 50%～70%、光照 1000 Lux～5000 Lux。 移栽温室 4.6 应具有遮光设施，遮阳率 25%～50%、温度 15℃～25℃、相对湿度 50%～70%、自然光照，光照过 于强烈时采取遮光措施。 5 组培技术 技术路线 5.1 组培技术路线：外植体选取→茎尖接种→扩繁培养→生根培养→病毒检测→炼苗→移栽。 组培流程 5.2 5.2.1 外植体选取 选取无病虫害、长势健壮的品种作为取样母株，截取健康、幼嫩、无病虫害的新梢，放置于室内水 培 5 d～7 d。 5.2.2 培养基配置 培养基采用 WPM为基本培养基，以 6-BA、IBA为常用激素，活性炭作为去除褐化常用吸附剂，不同生 长过程培养基配方如下： a) 茎尖接种培养基： WPM+0.4 mg ·L-1～ 0.8 mg·L-1 6-BA+6.0 g ·L-1琼脂+25.0 g·L-1蔗糖+0.6 g·L-1活性炭； DB34/T 4625 —2023 3 b) 扩繁培养基： WPM+0.4 mg ·L-1～ 0.6 mg·L-1 6-BA+6.0 g ·L-1琼脂+25.0 g·L-1蔗糖+0.2 g·L-1 活性炭； c) 生根培养基： WPM+0.5 mg ·L-1 IBA+6.0 g ·L-1琼脂+25.0 g·L-1蔗糖。 5.2.3 接种 剪取茎尖顶端 1.0 cm～2.0 cm 作为接种外植体，采用 0.10% HgCl 2和无菌水对外植体灭菌，在接 种室无菌环境下，通过解剖镜剥取长度为 0.10 mm～0.15 mm 的茎尖生长点，接种于培养基中，培养 30 d～40 d。 5.2.4 扩繁 用组培苗作为外植体，切去增生愈伤后，接种于扩繁培养基中，培养 25 d～35 d。 5.2.5 生根 剪取扩繁苗 1.0 cm～1.5 cm的不定芽茎段作为外植体，接种于生根培养基中，插入深度 0.25 cm～ 0.35 cm，培养 30 d～40 d。 5.2.6 炼苗 选取根长 0.6 cm～0.8 cm、带有毛状根的组培苗，置于炼苗室，打开组培瓶盖，在光照 1000 Lux～ 2000 Lux 条件下炼苗 1 d～2 d 后，在光照 3000 Lux ～5000 Lux 条件下炼苗 2 d～3 d。 5.2.7 移栽 选取炼苗后长势健壮组培苗作为移栽苗，用清水洗净根部培养基，移栽至 32 孔标准配制基质（草 炭：蛭石：珍珠岩 =3：1：1）穴盘内。移栽要求：温度 22℃～28℃，相对湿度 30%～50%，自然光照条 件。 5.2.8 田间管理 按照 GB/T 8321 （所有部分） 和 LY/T 1893 的规定执行。 5.2.9 苗木出圃 按照 DB34/T 3410 的规定执行。 6 病毒检测 石榴苗木病毒主要检测对象 6.1 如下： —— 石榴花叶病毒（ PoMv, Pomegranate mosaic virus ）； —— 李坏死环斑病毒石榴花叶株系（ PNRSV, Prunus necrotic ringspot virus, pomegranate mosaic strain ）。 样本抽样 6.2 6.2.1 移栽苗木抽样 DB34/T 4625 —2023 4 采用随机取样法，抽取移栽苗木进行病毒检测。以 1千株为基数（＜ 1千株的，以 1千株计算）， 1 万株内（含 1 万株），每增加 1千株增检 10 株，≥1 万株，每增加 1 千株增检 2 株。抽样检测时间 为移栽成活后 3 月～6 月内。 6.2.2 出圃苗木抽样 采用随机取样法， 抽取出圃苗木进行病毒检测。 以 1 万株为基数 （＜ 1 万株的， 以 1 万株计算） ， 10 万株内（含 10 万株），每增加 1 万株增检 5 株，≥10 万株，每增加 1 万株增检 2 株。 检测方法 6.3 推荐使用反转录 ——聚合酶链式反应检测法（ RT-PCR），选用试剂盒进行 RNA提取及RT-PCR检测。 推荐引物见表 1。 表1 推荐RT-PCR法检测病毒对象及引物序列 检测病毒名称 推荐引物序列 石榴花叶病毒（ PoMv） 3′- GCATAGTGCTTCCGTTCAC 5′- TGCAGAATTACTGCCCATAGAAAC 李坏死环斑病毒石榴花叶株系（ PNRSV） 3′- CTGTACCACACTGAAAATATATGTTATCAAG 5′- CTTGATAACATATTTTCAGTGTCCATACAG 样品保存 6.4 抽取样品后，要求抽取样品一式两份，一份用于检测，一份由密封袋标记好时间、地点、样品名称 后，放置于 -80℃ 冰箱中冻存备份。 病毒检测要求 6.5 6.5.1 移栽苗 移栽苗木检测，其带有检测对象的病毒株允许率≤ 0.1%。 6.5.2 出圃苗 出圃苗木检测，其带有检测对象的病毒株允许率＜ 0.3%。 7 质量