ICS 65.020.30 CCS B 41 37 山东省 地方标准 DB37/T 4674—2023 猪塞尼卡谷病毒的检测 重组酶恒温扩增 法 2023 - 11 - 14发布 2023 - 12 - 14实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4674 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工 作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 DB37/T 4674 —2023 1 猪塞尼卡谷病毒的检测 重组酶恒温扩增法 1 范围 本文件描述了猪塞尼卡谷病毒（ Seneca Valley virus, SVV ）的重组酶恒温核酸扩增检测 （Recombinase Polymerase Amplification ）方法。 本文件适用于猪塞尼卡谷病毒的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用 于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所用液体试剂均需使用无 DNA/RNase 的容器进行分装。 RNA提取试剂盒：市售。 4.1 重组酶恒温扩增试剂盒：市售。 4.2 水：GB/T 6682 ，一级。 4.3 PBS溶液：pH值7.4。 4.4 称取磷酸二氢钾 (KH2PO4) 0.27 g、磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 1.42 g、氯化钠 (NaCl) 8 g、氯化钾 (KCl) 0.2 g，加灭菌水约 800 mL充分搅拌溶解，加入浓盐酸调 pH值至7.4，定容至 1 000 mL。 0.1% DEPC 水。 4.5 1 000 mL水中加1 mL DEPC，放在1 000 mL容量瓶中静置 4 h后备用。 重组酶恒温扩增检测引物：按附录 A规定。 4.6 阳性、阴性对照。 4.7 —— 阳性对照：带有 SVV序列DNA全长的质粒。 —— 阴性对照：已知 SVV阴性样本的 DNA。 5 仪器设备 荧光定量 PCR仪：配有配套反应管（板）。支持多通道检测。 5.1 分析天平：精度为 1 mg。 5.2 DB37/T 4674 —2023 2 高速冷冻离心机：转速不低于 13 000 g/min。 5.3 冰箱：2 ℃～8 ℃和-20 ℃以下。 5.4 酸度计。 5.5 电热恒温水槽：室温至 100 ℃。温度精度± 0.5 ℃。 5.6 涡旋振荡器。 5.7 微量移液器： 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 5.8 离心管： 1.5 mL。无DNase和RNase。 5.9 6 试验步骤 样品 6.1 符合GB 19489 和NY/T 541 中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集和保存的要求。 6.1.1 样品采集 6.1.1.1 棉拭子样品 无菌采集猪口鼻棉拭子。 6.1.1.2 组织样品 按照NY/T 541兽医诊断样品采集、在运抵检测地点前的样品保存与运输技术规范确定的规程，无菌 采集病死猪的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。 6.1.2 样品的保存 2 ℃～8 ℃不超过 24 h，-20 ℃以下不超过 3个月，-70 ℃以下不超过 10年。 6.1.3 样品处理 6.1.3.1 棉拭子样品处理方法 口鼻拭子管 6 000 g/min震荡45 s，取200 μL进行RNA提取。 6.1.3.2 淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理 取0.05 g（±0.01 g）组织块放入盛有 500 μLPBS缓冲液的研磨管中， 6 000 g/min震荡研磨 45 s，制 成约10%的组织匀浆液， 5 000 g/min离心5 min，取200 μL上清液进行 RNA提取。 RNA的提取 6.2 按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的 RNA。 提取的RNA应立即检测， 否则应置于 -70 ℃冻存。 重组酶恒温核酸扩增 6.3 6.3.1 扩增试剂准备 设50 μL重组酶恒温核酸扩增反应体系，扩增反应液体系见表 1。按重组酶恒温扩增试剂盒说明书 配制体系并完成相关操作。 DB37/T 4674 —2023 3 表1 扩增反应液体系 组分 用量 μL 1% DEPC水 25.4 10 μM SVV-F 2 10 μM SVV-R 2 10 μM SVV-Probe 0.6 模板 5 恒温扩增试剂 15 6.3.2 恒温扩增反应 选择检测模式： FAM。将加样后的 PCR管放入荧光 PCR检测仪内，做好标记。恒温扩增反应条件按照 表2设置。 表2 恒温扩增反应条件 反应温度 39 ℃ 循环数 40 信号采集 每30 s 反应时间 20 min 结果判定 6.4 6.4.1 阴性、阳性结果判定 结果判定见表 3。 表3 结果判定 序号 通道 Ct值 结果判断 1 FAM UNDET或40 样本低于检测限，报告为阴性 2 FAM ≤37 判定为阳性 3 FAM 37～40 复检一次，如仍为 37～40，则判定为阴性 6.4.2 质控标准 6.4.2.1 阴性对照无 Ct值或大于 37，并且无扩增曲线。 6.4.2.2 阳性对照的 Ct值应小于等于 37，并出现典型的扩增曲线。 6.4.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 6.4.2.4 结果参考图谱见附录 B。 DB37/T 4674 —2023 4 A A 附录 A （规范性） 重组酶恒温核酸扩增引物 重组酶恒温核酸扩增引物见表 A.1。 表A.1 重组酶恒温核酸扩增引物 引物 序列 SVV-F 5’- TTCTAAAGCGCAAATTCGTCCAAAACAACGACG -3’ SVV-R 5’- CCAGAATGTTGAGCCAACATAGAAACAGATTGC -3’ SVV-Probe 5’- TAAAGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTC (FAM -T) (THF) (BHQ1 -T) AGGAACACTACTCG -C3 spacer -3’